北极海洋红球菌(Rhodococcus sp.)B7740生长条件优化及其菌体色素分离、提取与特性分析

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极地复杂、多样的生境造就了丰富多样的极地微生物,它们可能产生其他微生物所不能产生的生物活性物质,如低温酶、抗菌抗肿瘤物质及抗冻物质等。自1908年从南极分离出第一株微生物以来,各国研究人员积极参与极地微生物的研究,证明了极地是一个潜在的、重要的微生物资源宝库,具有广阔的开发前景。  本实验首先对分离自北冰洋海水的红球菌(Rhodococcus sp.)B7740的培养基成分和发酵条件进行了优化,然后探讨了其产生的类胡萝卜素的提取条件,并研究了该色素粗品的理化性质,最后,采用紫外可见分光光度法(UV-Vis)、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液质联用法(LC-MS)对该色素组分进行了初步分析。研究结果如下:  1红球菌B7740发酵条件优化  通过单因素实验从葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸钾及尿素中筛选出对B7740生长有显著促进作用的碳源和氮源物质,再进行 L9(34)正交实验,得出最佳碳源、氮源的比例。在此基础上,分别考察了培养温度、起始pH、接种量、装液量等对B7740菌株生长的影响。结果表明,1L陈海水中添加5 g葡萄糖、3 g乳糖、5 g酵母粉和7 g牛肉膏为B7740培养基碳源与氮源物质的最佳配比;25℃,起始pH7,装液量250 mL/500 mL三角瓶,接种量1%,160 r/min培养5 d,B7740生物量(湿菌体)达到23.08 mg/mL,比条件优化前的6.1 mg/mL提高了278.4%。  2红球菌B7740菌体色素提取方法初探  以上述优化条件培养得到的B7740菌体为材料,考察丙酮、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、环己烷、正丁醇、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、甲醇、蒸馏水等溶剂对菌体色素的提取效果,选出最佳提取剂。并通过单因素和正交实验得出色素提取的最佳温度、料液比、pH、提取时间、提取次数等参数。同时,采用浓硫酸显色法和三氯化锑显色法对色素提取物进行了分析。结果表明,以pH7的无水乙醇为提取剂,1 g干菌体中加入30 mL无水乙醇,75℃,提取1 h,色素得率达到1160.62μg/g干菌体,重复提取2次可将菌体中85%以上的色素浸提出来。浓硫酸显色和三氯化锑显色分析初步表明该色素主要为类胡萝卜素。  3红球菌B7740色素粗提物特性分析  将上述获得的色素粗品粉末用无水乙醇溶解配制成浓度为0.5%的色素溶液,研究了不同pH、温度、光照强度,以及金属离子、氧化还原剂、常用食品添加剂、抗氧化剂等对其稳定性的影响。结果表明,强酸性环境不利于色素溶液的稳定存在,而在弱酸性、中性和碱性环境中稳定性较好。色素在-20~80℃范围内稳定性好,80℃处理8h后色素残存率大于85%。色素溶液对室外阳光直射(8月)极为敏感,暴露24 h残存率不到10%;在室内(25℃)避光条件下素色稳定性较好,处理48 h之后,色素残存率在80%以上;而室内自然光对色素影响较大,处理48 h后,残存率50%左右。0.1 mol/L的Mn2+、Fe2+和Fe3+对色素有极显著破坏作用,处理24 h后残存率分别为51.1%、68.4%和7.5%;氧化剂H2O2对色素也有极显著影响破坏作用,随着H2O2浓度的提高(0.3%~1.5%)残存率逐渐降低;色素溶液对还原剂 Na2SO3(0.02%~0.1%)耐受性强,处理72h后残存率在95%以上。抗氧化剂TBHQ和BHT对色素有一定的保护作用,相反,同为抗氧剂的Vc(1%~3%)却对色素有极显著的破坏作用,3%Vc处理72 h残存率为54.7%。食品添加剂EDTA、山梨酸钾、苯甲酸钠、柠檬酸、乙酸、蔗糖和葡萄糖对色素的稳定性均无显著影响。  以β-胡萝卜素标准品为对照,采用紫外可见分光光度法(UV-Vis)、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)及液质联用法(LC-MS)对上述提取获得的B7740菌体色素进行分离和分析。结果表明,色素中含有β-胡萝卜素,可能含有叶黄素、β-隐黄质、环氧玉米黄质和新黄质,以及这些色素与脂肪酸形成的衍生物等类胡萝卜素。
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