创伤性脑损伤后脑内NF-κB的双相激活及PDTC分时程干预的实验研究

• 作 者: 胡阳春
• 机 构: 南京大学
• 出 处: 南京大学
• 发表日期: 2014年01期
• 关键词: 创伤性脑损伤 核因子-κB 双相激活 吡咯烷二硫代氨基甲酸 炎性反应

研究背景和目的:研究表明无菌性炎性反应在创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）后的继发性脑损伤中发挥着重要作用。众所周知,炎性反应的调控中枢是核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）。尽管对NF-κB已做大量研究,然而对于其具体作用,目前仍有争论。文献报道,在缺血缺氧（hypoxia-ischemia,HI）和蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,S AH）模型中,脑内NF-κB存在两个激活高峰,且早期激活后可诱导炎性反应加重脑损伤,而在后期激活后则起到脑保护作用。同时,我们前期研究也发现:在TBI后NF-κB可被显著激活,并在TBI后7天仍处于较高水平（高于正常对照组）。于是,我们推测脑内NF-κB可能在TBI后期仍发挥着某种重要作用,然而,对于TBI后NF-κB的长时程观察至今鲜有报道。因此,本课题将进一步延长观察时程,监测TBI后脑内NF-κB的长时程激活情况（至14天）及其亚单位的表达变化;并根据实验结果选择相应的时间点,分别应用NF-κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）,对 NF-κB 分时程干预,系统评价PDTC对TBI后NF-κB活性及其亚单位水平的作用,从而探讨PDTC分时程干预对TBI后继发性脑损伤的影响。方法:使用成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠制作TBI动物模型,并将其分成假手术组,TBI后1天组,TBI后3天组,TBI后5天组,TBI后7天组,TBI后10天组和TBI后14天组。电泳迁移率检测（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测大鼠外伤后14天内挫伤灶周围脑组织NF-κB活性,Western blot检测NF-κB亚单位的p65和c-Rel蛋白表达水平,免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色对p65和c-Rel核阳性细胞半定量;酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定大鼠脑组织中炎性因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量。并根据前期实验结果,选择TBI后NF-κB的两次激活高峰（TBI后3天和10天）作为时间点进行早、晚期界定,应用PDTC干预;TBI后3天+PDTC治疗组在TBI后半小时经腹腔注射PDTC（100mg/d/kg）至TBI后3天,TBI后10天+PDTC治疗组在TBI后第4天经腹腔注射PDTC（l00mg/d/kg）至TBI后第10天,按照相应时间点分别留取脑组织标本,再用EMSA检测PDTC干预后的NF-κB活性,Western blot检测NF-κB亚单位p65和c-Rel的蛋白表达水平,ELISA测定炎性因子TNF-α和IL-1β的含量,尼氏染色用来观察脑组织中神经元的存活情况,行为学评分观察神经功能恢复情况。结果:大鼠TBI后14天内创伤灶周围脑组织中脑内NF-κB呈双向激活,且激活高峰分别位于伤后第3天和第10天;同时,其亚单位p65的核蛋白表达水平也于伤后第3天和第10天分别达到高峰,且于3天时峰值较为明显,并在伤后第14天降至基线水平;而NF-κB另一主要亚单位c-Rel则在外伤后呈缓慢上升趋势,随观测时间延长而逐渐升高,并在伤后第14天仍表现为上升趋势;另外,炎性因子TNF-α和IL-1β蛋白水平在TBI后也具有双相增高的特点。针对TBI后脑内NF-κB的不同激活高峰,分时程应用PDTC干预后,NF-κB的活性及p65、c-Rel的蛋白水平均有明显抑制,且p65蛋白水平降低更为明显;同时炎性因子TNF-α和IL-1β的蛋白水平也明显降低。另外,TBI后分时程应用PDTC均能增加神经元存活数量,并可促进神经功能恢复。结论:大鼠TBI后脑内创伤灶周围NF-κB呈双相激活模式;且其亚单位p65和c-Rel存在不同激活时相:p65在早期即可被激活,而c-Rel则在晚期激活。TBI后分时程应用PDTC均能明显抑制NF-κB的活性,降低p65和c-Rel的蛋白水平,减少炎性因子TNF-α和IL-1β的含量;并可显著增加神经细胞存活数量,促进神经功能恢复。以上结果提示:PDTC在TBI后继发性脑损伤中的防治中可能具有潜在的应用价值。