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[目的]
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％[2]。近年来,我国乳腺癌发病率增长速度也明显加快。目前手术切除仍是治疗乳腺癌最主要而有效的方法,但是5年生存率一直未有明显提高[3]。因此,如何改善预后提高生存率是亟待解决的问题。随着分子生物学的发展,肿瘤的基因治疗取得了明显的进展,越来越多的基因治疗方案获准或正在进行临床试验。抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中所发挥的特殊作用,使抑癌基因疗法成为肿瘤基因治疗的重要策略之一。新近发现的抑癌基因PTEN在肿瘤发生、发展及其它许多方面发挥重要的作用(见文后综述)。另外,PTEN还能抑制癌细胞的浸润转移,降低其迁移能力(见文后综述)。这就提示PTEN用于癌症基因治疗方面有着重要意义。实验研究还发现PTEN能增加癌细胞对化疗药物的敏感性,预示着应用PTEN基因治疗和化疗联合治疗的可行性。本实验采用安全的、高效转染的腺病毒载体,在两种人乳腺癌细胞株中导入野生型抑癌基因PTEN,使在癌细胞内过表达野生型PTEN,以研究PTEN基因抗肿瘤作用机制,并用化疗药物表阿霉素作用于转染PTEN基因的乳腺癌细胞,观察PTEN诱导癌细胞对表阿霉素的敏感性。本实验的实施不仅丰富了抑癌基因PTEN应用于肿瘤基因治疗的理论基础,还可以为将来临床应用肿瘤的基因治疗合并化疗药物的联合治疗提供实验依据。
[方法]
首先,经293A细胞扩增和纯化后,采用50%组织培养感染剂量法测定扩增得到的重组腺病毒的病毒滴度,检测野生型PTEN基因重组腺病毒对乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-1的感染效率,并确定最佳感染复数。RT-PCR和Westem blotting检测感染野生型PTEN基因重组腺病毒后PTEN基因的表达。其次,流式细胞仪、Hoechst33258染色、DNA ladder分析和Western Blotting检测野生型PTEN基因重组腺病毒对乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-1细胞周期和凋亡的影响。最后,在乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-1中,通过CCK-8细胞毒性分析试验检测野生型PTEN基因重组腺病毒对化疗药物表阿霉素敏感性的影响。
[结果]
(1)纯化后的野生型PTEN基因重组腺病毒病毒滴度为1.3×108 pfu/ml。确定对MCF-7和ZR-75-1细胞的最佳感染复数MOI(multiplicity of infection)为100。
(2)检测到野生型PTEN基因重组腺病毒感染后MCF-7租ZR-75-1 PTEN mRNA过表达,PTEN蛋白表达随感染时间延长逐渐增加。
(3)野生型PTEN基因重组腺病毒感染MCF-7和ZR-75-1后,可显著抑制其生长和增殖,G1期细胞比例显著增高,细胞凋亡率明显增加,p53表达水平上调,p21表达水平上调,Bax表达水平上调,Bcl-2表达水平下调。
(4)野生型PTEN基因重组腺病毒感染后,胞核染色显示,乳腺癌细胞ZR-75-1胞核缩小碎裂,呈大小不等的不规则块状、圆形或花瓣状的细胞碎片。而在乳腺癌细胞MCF-7中出现核的致密浓染和强荧光。
(5)乳腺癌细胞MCF-7经野生型PTEN基因重组腺病毒感染72h后,基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳可见较为明显的“梯状”条带;而乳腺癌细胞ZR-75-1在野生型PTEN基因重组腺病毒感染的48h和72h后基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳可见较为明显的“梯状”条带。
(6)野生型PTEN基因重组腺病毒感染MCF-7和ZR-75-1后,使MCF-7细胞对表阿霉素的敏感性增加了2倍左右,使ZR-75-1细胞对表阿霉素的敏感性增加了10倍左右。
[结论]
野生型PTEN基因重组腺病毒经293A细胞扩增、纯化后获得高滴度的重组腺病毒,经感染乳腺癌细胞系后可稳定显著表达。野生型PTEN基因重组腺病毒感染明显抑制乳腺癌细胞生长,发生G1期细胞阻滞,细胞凋亡率增加及影响p53,p21,Bax和Bcl-2表达。Hoechst33258染色和DNA降解片段分析显示,乳腺癌细胞MCF-7和ZR-75-1经野生型PTEN基因重组腺病毒感染后均出现一定程度的凋亡。此外,野生型PTEN基因重组腺病毒感染增加乳腺癌细胞对化疗药物表阿霉素的敏感性。使MCF-7细胞对表阿霉素的敏感性增加了2倍～3倍,使ZR-75-1细胞对表阿霉素的敏感性增加了6倍～10倍。本研究的结果可为进一步乳腺癌的体内PTEN基因治疗研究,乃至为将来临床应用肿瘤的基因治疗合并化疗药物的联合治疗提供实验依据。