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颅脑外伤在神经外科中常见,但其致残率及致死率占全身各器官损伤之首。目前临床的治疗手段主要是通过神经营养及神经康复理疗促进神经元的发生及突触的修复连接,但由于人脑已难以自我修复损伤神经元及产生功能性神经元,因而难以达到理想的疗效;细胞移植为脑外伤治疗提供了一种新的治疗方法,即移植细胞后可补充或再生受损神经细胞。由于神经干细胞存在取材困难以及其自身具有向肿瘤细胞分化的潜在的特性,神经干细胞的移植难以应用于临床,而骨髓基质干细胞经研究发现,在体外一定条件下可向神经细胞分化,包括神经干细胞及神经元,同时具有取材方便,传代稳定等特点,因此应用骨髓基质干细胞治疗脑外伤成为颅脑外伤治疗的希望。血清是细胞培养的重要成分,对细胞的分裂增殖及生命活动具有重要作用。但细胞分化对微环境的影响非常敏感,尤其在有血清培养体系的细胞分化实验中,血清浓度高低可能导致分化结果迥异。本研究通过对不同血清浓度下,诱导人骨髓基质干细胞向神经细胞分化的效率的比较,初步探讨了微环境对骨髓基质干细胞分化的影响作用,发现低浓度血清对骨髓基质干细胞分化起促进作用,而高浓度血清起抑制作用,为骨髓基质干细胞的体外分化调控及临床应用提供重要资料。1人骨髓基质干细胞的原代培养、鉴定目的通过稳定可靠的骨髓基质干细胞体外培养模型,获得大量骨髓基质干细胞。方法取志愿者骨髓5ml并于体外以密度为1.073g/mlPercoll分离液分离,吸取中间絮状细胞层,以DMEM/F12+15%FBS进行培养,48h后发现细胞贴壁,换液后继续培养,7-8天见细胞铺满瓶底。结果7-8天后见细胞聚集成团,栅栏状、漩涡状排列,细胞呈梭形、星形或三角形,CD34、CD105免疫组化染色显示,CD34阴性,CD105阳性。结论实验中原代培养细胞为骨髓基质干细胞。2微环境对骨髓基质干细胞向神经细胞分化的影响目的通过对不同血清浓度下,诱导人骨髓基质干细胞向神经细胞分化的效率的比较,探讨如何提高人骨髓基质干细胞向神经细胞分化率。方法体外培养获得原代骨髓基质干细胞,鉴定后取第3代培养细胞,分别在1%,2%,5%,10%,15%,20%的血清浓度下用10ng/mlbFGF+10ng/mlEGF预诱导72h后,0.1umol/LRA、10ng/ml GDNF+10ng/mlBDNF正式诱导,并与无血清组比较,7天后进行荧光免疫组化染色,分别检验Nestin、NSE及GFAP的表达。结果各组经正式诱导1d后有部分BMSC开始收缩,细胞呈圆形,加血清组的BMSC生长速度快,细胞核分裂相多,部分细胞出现神经元及神经胶质细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起。荧光抗体染色后荧光显微镜观察到,2%血清组NSE、nestin显色最多,GFAP最少。结论bFGF、EGF和RA、GDNF、BDNF可以联合诱导BMSCs向神经元样细胞分化,而2%血清浓度可起促进作用,且神经元分化率最高。3自体骨髓基质干细胞移植对脑外伤后神经功能障碍患者治疗作用的临床观察目的通过观察自体骨髓基质干细胞移植对外伤后神经功能障碍患者作用的效果,对细胞移植治疗脑外伤的安全性及疗效进行分析,为细胞移植工作进一步推广奠定基础。方法体外培养获得原代骨髓基质干细胞,鉴定后取第3代培养细胞,经无菌测试合格,且经医院伦理委员会同意,家属签字后,予1名外伤后植物生存状态患者经颅置入Ommava囊,经Ommaya囊注射骨髓基质干细胞至侧脑室,细胞浓度为1×10e5个/ml,另外2名患者通过鞘内注射干细胞的方法移植。结果移植细胞一周后植物生存患者未出现发热、癫痫等症状,肢体肌张力下降,持续一段时间后变高,3个月后四肢肌张力降低,眼球也由原来不能追踪注视变为可追踪注视,头颅CT检查及PET-CT结果显示:有患侧颞叶有新生脑组织及脑组织的代谢。另2名患者移植后均出现不同程度的好转,表现为肌张力下降,肌力恢复。3名患者的脑脊液BDNF浓度均在术后1、3、5、7天逐渐升高,14天后下降。结论骨髓间充质干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失不仅在理论上具有可行性,而且临床实践结果也支持该结论。