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普那霉素(pristinamycin)是由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生的链阳性菌素类抗生素,对革兰氏阳性菌有较强的杀菌活性,主要用于治疗由革兰氏阳性菌包括耐药菌引起的感染。普那霉素经过化学修饰得到的水溶性衍生物喹奴普丁/达福普丁对耐药性革兰氏阳性菌具有很强的杀菌作用,且有较长的抗生素后效应和不易产生耐药性等优点,是目前治疗由耐药的革兰氏阳性菌引起的感染最有效的抗生素之一。 本文运用基因组重排技术对普那霉素产生菌进行育种,筛选高产菌株。 首先,试验考察了原生质体制备、再生以及融合的最佳条件。试验结果发现普那霉素产生菌始旋链霉菌(S.pristinaespiralis11—2)在含0.5%甘氨酸的种子培养基中培养到对数生长期,收集菌丝体,经2mg/ml溶菌酶在30℃下作用90min可获得大量的原生质体,其再生率为5.1%。以再生菌株S.pristinaespiralis ZP—7作为出发菌株进行原生质体制备和再生,其再生率能达到25.2%,后者比前者有了极大的提高。S.pristinaespiralis ZP-7原生质体在浓度为40%、分子量为6000的聚乙二醇作用下,其融合率能达到10.3‰。 再次,对出发菌株S.pristinaespiralis ZP—7原生质体进行紫外线诱变,得到发酵水平略有提高的群体,然后通过循环原生质体融合在这一群体中进行基因组重排,同时进行非重排的对照试验,即反复原生质体制备和再生,而不经PEG融合。 试验结果表明经过基因组重排后得到的子代群体F4对自身代谢产物普那霉素的最低耐受浓度为100μg/ml,而出发菌株S.pristinaespiralis ZP—7的最低耐受浓度为20μg/ml,对照试验的子代群体P4的最低耐受浓度为35μg/ml。这说明与重复的原生质体制备和再生所引起的诱变相比,F4群体表型的显著改进与基因组重排有关,即由PEG介导的原生质体反复融合有关。将100μg/ml普那霉素抗性平板上筛选得到的菌株进行发酵复筛,得到5株普那霉素产量超过1.4g/L的重组菌株:F4—5、F4—6、F4—10、F4—17、F4—29,他们的产量分别为1.523g/L、1.401g/L、1.401g/L、1.591g/L、1.562g/L,分别比出发菌株S.pristinaespiralis ZP—7(产量为0.893g/L)提高了70.5%、56.9%、56.9%、78.2