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目的:运用分子克隆技术构建ankrd49真核表达重组质粒并建立ankrd49稳定过表达的小鼠精原细胞系(GC-1)细胞模型;分析ankrd49过表达对UV诱导GC-1细胞凋亡的影响,探讨NF-κB信号通路是否参与ANKRD49对UV诱导GC-1细胞凋亡的调控,并进一步探讨ANKRD49蛋白激活NF-κB信号通路的具体机制,为深入研究该基因的作用及其在精子发生中的调控机制提供思路。方法:1.利用分子克隆技术构建ankrd49真核表达重组质粒pMSCVpuro-ankrd49-flag;2.建立ankrd49稳定过表达的GC-1细胞模型,并采用RT-PCR和Western blotting检测ankrd49 mRNA和蛋白质的表达水平;3.通过Hoechst33258染色对紫外线(UV)诱导的GC-1细胞凋亡状况进行分析;4.运用流式细胞术检测过表达ankrd49基因对UV诱导的GC-1细胞凋亡率和线粒体膜电位下降率的影响;5.运用Caspase-3酶活性检测试剂盒检测过表达ankrd49基因对GC-1细胞Caspase-3酶活性的影响;6.利用Western blotting检测过表达ankrd49基因后GC-1细胞内凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶—PARP(poly ADP-ribose polymerase)、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表达变化;7.利用流式细胞术、caspase-3酶活性检测试剂盒和免疫印迹技术分别检测过表达ankrd49的gc-1细胞中加入nf-κb信号通路抑制剂(pdtc)后,gc-1细胞的凋亡率、caspase-3酶活性和凋亡相关蛋白parp、cleaved-caspase-3、bcl-xl和bax的表达变化情况;8.分别提取过表达组和空载体组细胞胞浆总蛋白和核蛋白,并采用westernblotting检测p65蛋白的亚细胞定位。结果:1.pcr扩增、双酶切分析及dna序列测定结果均表明真核表达重组质粒pmscvpuro-ankrd49-flag构建成功;2.rt-pcr和westernblotting检测结果显示ankrd49基因在gc-1细胞中实现了稳定过表达;3.hoechst33258染色结果显示,ankrd49稳定过表达组细胞的凋亡百分比为(0.03±0.01)×100%,明显低于空载体组(0.23±0.05)×100%和裸细胞组(0.25±0.04)×100%,(p<0.01);4.流式细胞术结果显示过表达ankrd49组细胞的早期凋亡率为2.71%±0.50%,明显低于空载体组11.66%±1.01%和裸细胞组11.31%±1.74%,过表达ankrd49组细胞的线粒体膜电位下降率为11.51%±1.53%,明显低于空载体组和裸细胞组(30.54%±2.42%和28.99%±1.61%),(p<0.01);5.caspase-3酶活性实验结果显示过表达ankrd49组细胞caspase-3酶活性为1.09±0.15,明显低于空载体组(3.01±0.32)和裸细胞组(3.12±0.23),(p<0.01);6.westernblotting检测结果显示ankrd49稳定过表达组cleaved-parp、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平明显低于对照组,而bcl-xl蛋白表达水平显著高于对照组;7.过表达ankrd49的gc-1细胞中加入nf-κb信号通路抑制剂(pdtc)后,经过流式细胞术检测表明pdtc处理组细胞早期凋亡率明显高于pdtc未处理组(p<0.01),caspase-3酶活性实验结果显示pdtc处理组caspase-3酶活性明显升高(p<0.01),westernblotting检测结果显示pdtc处理组细胞内cleaved-parp、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平明显增高,而Bcl-x L蛋白表达水平明显降低(P<0.05);8.提取空载体组和过表达组细胞胞浆和核蛋白进行Western blotting检测,结果表明ANKRD49可以促进p65蛋白入核(P<0.01)。结论:1.成功构建了ankrd49的真核表达重组质粒,并建立ankrd49稳定过表达GC-1细胞模型。2.ANKRD49蛋白对UV诱导GC-1细胞凋亡具有抑制作用。3.ANKRD49蛋白通过激活NF-κB信号通路抑制GC-1细胞凋亡。