论文部分内容阅读
目的：脑出血(Intracerebral Hemorrhage ICH)是发病率、死亡率、致残率均高的急性脑血管病类型。虽然现在有关脑出血的内、外科常用治疗方法对于急性期挽救生命有一定作用，但远期效果都尚不令人满意。因此，寻找治疗ICH有效的药物并探讨其作用机理的工作正广受关注。目前脑出血的基础与临床研究方向都着眼于减少损伤后神经元的缺失以改善行为学缺陷。自从1992年Reynold和Weiss等首次报道分离成体海马神经干细胞(Neural stem cell NSC)，很多研究者看到了治愈这一系列相关中枢神经系统疾病的美好前景。但是，目前所获的相关进展主要是试图采用NSC移植以替代缺失神经元或做基因治疗，很多工作都还处在现象描述的层面，很多基础性问题有待回答，而且其中还存在许多伦理问题有待解决，因此NSC直接用于临床还有很长的路要走。同时，还有许多证据显示，很多脑的急、慢性损伤中都有神经发生和内源性NSC活化的现象，从而使调节损伤脑的微环境，调动内源NSC参与修复这一治疗策略成为可能。脑溢安(NYA)是我研究所开发的适用于脑出血急性期的中药三类新药，大量临床与实验研究都证实了其作用与机制，而且前期实验证明它对培养的NSC生存、增殖和分化有良性作用。本实验试图观察脑出血大鼠脑内移植NSC和内源性NSC的变化及脑溢安的可能影响，从NSC的角度探讨其作用机制。 方法：一、将SD大鼠随机分为4组：正常组(5只)、假手术组(5只)，模型组(25只)，脑溢安治疗组(25只)。用Ⅶ型胶原酶立体定位注入大鼠右侧苍白球内(前囟后1.40mm，矢状缝右3.20mm，深5.60mm)复制脑出血动物模型，予NYA浸膏4.92g/kg/d灌胃。术后1d，3d，6d，13d，27d于各组随机抽取动物，予50mg/kg5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-Deoxyuridine BrdU)腹腔给药(8h内，每隔4h给药一次，共3次)，次日将动物灌注固定处死，取脑切片。用免疫组织化学方法，观察NSC的特异性标志物巢蛋白Nestin免疫阳性的细胞和BrdU标记的脑内新生细胞从出血后2天至28天的分布及数量变化规律和脑溢安的影响；二，由于本步实验一方面为了用移植细胞模拟内源细胞，以验证前面实验关于基底节脑出血神经干细胞主要来源于患侧sVZ，并向病灶迁移的结果；另一方面为了验证选择基底节脑出血时细胞增殖最活跃的部位为干细胞移植点的策略，因而细胞移植手术在脑出血之前进行。根据以上实验结果，在分离。培养、传代获得NSC的基础上，采用pEGFP转染或BrdU标记体外培养NSC后，将细胞移植入前囱前1石omm，矢状缝向右1．20mm，深 4．00mm的细胞增生活跃的前脑脑室下区 （Subventricula zoneSVZ），Zd后诱导脑出血模型，出血后7d处死动物检测EGFP或BrdU阳性细胞在血肿周围的分布情况。 结果：暂梁囫里给白亟双动物处死取脑后，观察各组脑组织一般情况，发现：与模型组比较，4d NYA组组织肿胀减轻明显，7l4dNYA组血肿吸收较快，28d时，NYA组病灶愈合较好，对周围组织结构影响小。提示脑溢安可明显促进脑水肿和血肿的吸收，减轻脑组织变性坏死，加快损伤修复。烟些华憧座容已鬓迷坡ub世亟径选金全级膻的基些脑出血大鼠脑内 Nestin和 BrdU阳性细胞主要分布于2个部位：血肿周围的基底节区、患侧室管膜及相邻的SVZ。Nestin阳性细胞还可见于四个处理的大脑腹侧弓状核附近，该处细胞数量与处理方法和出血时间关系不明显，提示脑出血对此处细胞无明显影响。正常组和假手术组基底节和室管膜及相邻的SVZ未见两种抗原的免疫阳性细胞。三个手术组（假手术组、脑溢安治疗组和模型组）健侧脑实质和两侧海马、嗅球均未见两种抗原的阳性细胞。Nestin阳性细胞有四种形态：第一种为胞体细小，突起细长而少的细胞，可能为迁移而来的神经干细胞；第二种细胞形状类似星形胶质细胞，胞体小，突起纤细；第三种细胞胞体巨大，有较长的突起，夹杂在前两种细胞当中；第四种细胞胞体小，有多个短突触，可能是反应性小胶质细胞。BrdU阳性核的形状多样，这与Nestin的阳性细胞多形态符合。血肿周围基底节阳性细胞计数发现：模型组大鼠脑内在Zd便可在血肿周围看到Nestin阳性的细胞，而后在4d、7d逐渐增多中＜0刀1＼并在14d达高峰中＜0刀5人 至28d细胞明显稀疏中＜0刀1人 脑溢安治疗组在 Zd、4d时，阳性细胞数较模型组无明显差异中＞0刀5人至7d，该值迅速上升达峰值，水平明显高于前组中＜0．01），并维持一个平台期至14d中＞0．05人到28d，水平明显下降一．01人且低于同期的模型组中＜0刀1人模型组大鼠脑内在Zd也可在血肿周围看到BrdU阳性的细胞核，而后在4d、7d逐渐增多中＜001），并在7d达高峰，并维持至14d，28d细胞核逐渐稀疏中＜0刀1）；脑 二且二 ／fy溢安治疗组在Zd、M时，阳性细胞数较模型组无明显差异中＞0刀5人至7