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牛结核病(Bovine Tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织(Office International DesEpizooties OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出：除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性牛一律捕杀来实现控制牛结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)，结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此，研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法，是控制牛结核病当务之急。牛分枝杆菌是细胞内寄生菌，MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6是M．bovis感染机体后分泌的主要抗原，诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时，灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强，而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力，使用时配比不均，难于进行标准化生产等问题也已凸显出来，鉴于以上原因，本研究之一是对四种牛分枝杆菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)进行了融合表达，旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。胶体金免疫层析技术(Gold-Immunochromatographic Assay GICA)是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高，而且不需昂贵仪器设备，操作简单快速。MPB83和MPB70已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原。MPB70和MPB83蛋白的氨基酸序列具有63％的同源性，单克隆抗体验证了二者具有某些共同抗原决定簇。本研究利用牛分枝杆菌的两个同源蛋白质MPB70和MPB83，建立了一种双抗原夹心胶体金免疫层析法。旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法。主要研究内容包括：1．牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析克隆了牛分枝杆菌特异性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的编码基因，构建原核表达载体，诱导表达蛋白，提纯融合蛋白质，并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应，说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示，融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性，作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理，用原核诱导表达的牛分枝杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备牛结核抗体检测试纸条。结果粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高；胶体金最佳标记pH值为6.0；MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg；MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg／mL；抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg／mL；交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应，具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于进口试纸条。3．牛结核病抗体胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病抗体胶体金快速检测方法制备的胶体金试纸条进行临床样品检测，并与牛结核分枝杆菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆菌分离培养的符合率为85％，与TST的符合率为79.73％，与韩国试纸条的符合率为98.75％。快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点，适用于对牛结核病进行普查和检疫，也可作为TST的辅助诊断方法，在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景。