大豆疫霉侵染大豆早期差异表达基因的筛选与功能分析

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由大豆疫霉(P.sojae)引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,每年造成大豆损失达10多亿美元。大豆疫霉是一种卵菌,卵菌在进化上和藻类同属于假菌界而和真菌相差很远,因此,很多病原真菌致病性分子机理并不适合于卵菌。目前植物病原卵茵的致病性在分子水平上还远未得到研究,对包括大豆疫霉在内的病原卵菌分子机理的研究有助于寻找到特异的防治卵菌病害的分子靶标,从而有利于病害的控制。本研究用SSH的方法试图从宏观的角度来分析大豆疫霉在侵染早期有哪些基因受到诱导,哪些基因受到抑制。另外,本研究从得到的基因中选择了磷脂过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶基因和能够引起烟草发生坏死反应的一种效应因子基因,分析了它们在致病过程及在非寄主抗性中的可能作用。 首先,为了确定大豆疫霉在侵染早期有哪些基因差异表达、参与了早期的互作过程,本研究采用了抑制性差减杂交技术,以离体培养的大豆疫霉为driver,以侵染大豆品种合丰35的大豆疫霉为tester,构建了侵染过程中上调和下调表达文库。通过点杂交(dot-blot microarray)和virtual Northern杂交筛选,共获得了487个克隆,经过DNA测序并在已知的核酸与蛋白数据库中比对分析,发现所获得的EST序列在这些数据库中均有高度同源序列,其中所有序列在大豆疫霉基因组数据库中均有高度配对的序列,最终这两个文库中共有105个unigene差异表达。经分析,这些基因在侵染时上调表达的有43个,下调表达的有62个,这些基因涉及能量代谢、转录、信号传导及氧化还原平衡等信号途径,提示大豆疫霉侵染大豆是一个复杂的多基因参与的过程。肌酸激酶在侵染时上调表达,而RT-PCR分析显示细胞色素c在侵染过程中随着肌酸激酶基因表达的增加而减少,提示大豆疫霉在侵染初期可能主要利用磷酸肌酸来维持其侵染所需要的能量。本研究首次报道了大豆疫霉在亲和互作条件下在侵染早期差异表达的基因,研究结果对认识大豆疫霉侵染早期与识别、侵入和定殖相关的分子机制有理论与实践意义。 从大豆疫霉与寄主互作的SSH文库的下调表达基因中得到了PsPHGPx基因。PHGPx具有抗细胞膜脂质过氧化的作用。在互作中寄主植物产生活性氧以抵抗病原茵的侵染,病原菌的抗氧化基因在亲和互作中上调表达,表明这些基因参与了侵染过程。本研究确认了大豆疫霉的PHGPx在亲和互作中的作用,同时还对其功能做了初步分析。在酵母中异源表达PsPHGPx能够抑制Bax诱导的酵母细胞凋亡。PsPHGPx受到H2O2等氧化压力以及其它逆境条件和钙离子的诱导,
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