论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌属于巴斯德菌科细小多形态杆菌,常定殖于健康猪上呼吸道中,但在一定条件下能侵入机体,引起以多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为特征的格拉瑟氏病。目前副猪嗜血杆菌已成为严重威胁全球养猪业的细菌性病原之一,但是对其致病机制及毒力因子了解甚少。副猪嗜血杆菌作为上呼吸道常在菌,粘附入侵对疾病的发生很重要。一些研究表明自转运蛋白是副猪嗜血杆菌的潜在毒力因子,且地方分离株SH0165的全基因组测序完成后预测其有4个自转运蛋白的开放读码框,其中一个为假基因,另外三个功能基因分别命名为AT1, AT2, AT3。自转运蛋白在多种革兰氏阴性菌中有报道,是一类有特殊结构的细菌外膜蛋白或者分泌蛋白,其结构主要由三部分组成：N末端可剪切的信号肽,中间的承载结构域也叫α域,以及C末端的转位单元也叫p域。其中信号肽介导蛋白跨越内膜,转位单元介导承载域跨越外膜。自转运蛋白有多种生物学活性,常与细菌的致病性相关,主要包括粘附、入侵、细胞毒性、生物被膜形成及血清抗性等。副猪嗜血杆菌的AT1是Va型分泌系统蛋白,其转位单元与百日咳杆菌的Pertactin有27%的同源性。因此,本实验以AT1为研究对象,对其功能进行研究。主要包括以下内容：1.at1全长及at1-pd克隆、测序以0165基因组DNA为模板,用引物ATIF/ATIR扩增at1全长,用引物ATIPF/ATIPR扩增atl-passenger domain (at1-pd)。at1全长扩增片段大小为2577bp, at1-pd目的片段大小为1566 bp。GeneBank登录号为NC 011852。2.AT1全长及AT1-PD原核表达分别将at1全长及at1-pd插入pET-30a和pET-28a原核表达载体,转化E.coli BL21 (DE3)后,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物表明,ATl全长表达在菌体沉淀中,大小约为100 kDa, AT1-PD与His融合表达,大小为85 kDa。不同诱导时间分析表明,0.8mM IPTG诱导4h蛋白表达量最高。AT1-PD融合表达后主要以可溶性蛋白存在,经Ni SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析柱纯化。3.AT1-PD单克隆抗体制备以纯化的AT1-PD为抗原,背部皮下免疫4-6周龄的Balb/c雌性小鼠,每次注射100μg弗氏佐剂乳化的蛋白,两周一次。融合前腹腔加强免疫100-300μg蛋白,细胞融合后用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清,经过至少3次有限稀释法克隆,获得阳性杂交瘤细胞株,腹腔注射小鼠制备腹水。本实验总共融合两次,获得9株杂交瘤细胞,并分别制备腹水,其中一株单抗腹水效价达100×29。随后通过Western-blot鉴定单克隆抗体,结果表明其特异性较好。4.猪气管上皮细胞的制备本实验采用未食初乳的乳猪,以链酶蛋白酶冷消化法制备猪气管上皮原代细胞。原代细胞可用于实验,传代后活性降低,最多可传6代。5.AT1蛋白的定位分别提取了工程菌pET-30a-AT1/BL21和副猪嗜血杆菌SH0165的外膜蛋白及分泌蛋白,以抗AT1-PD的单克隆抗体为一抗,通过Western-blot进行蛋白定位。结果表明,AT1蛋白在工程菌pET-30a-ATl/BL21和SH0165中均位于外膜上。6.AT1蛋白体外功能研究以猪肺上皮细胞(St.Jude porcine lung, SJPL)、猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cell, PIEC)及猪气管上皮原代细胞分别与展示有AT1蛋白的工程菌pET-30a-AT1/BL21互作,以只含空载体的pET-30a/BL21为阴性对照。粘附实验和间接免疫荧光结果表明,AT1可能与细菌的粘附相关。