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研究背景：真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是发展中国家常见的致盲性眼病,如不能及时诊断和治疗将导致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除。目前认为,机体的免疫功能与真菌感染和病情进展密切相关。因此深入研究角膜免疫防御体系,对寻找角膜抗真菌感染的有效途径有着重大的理论价值。角膜上皮细胞是角膜抵抗真菌的第一道天然免疫屏障,通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)发挥抗真菌的作用,PAMPs包括Toll样受体(Toll like receptors, TLRs),NOD样受体(NOD like receptors, NLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs)。TLRs, NLRs和CLRs相互作用,三者协同增强核转录因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)的激活,诱导炎性介质和抗菌肽分泌,如白介素(interleukin, IL)-1 β, IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor, TNF)-α,人β防御素(human betadefensin, hBD)-2和LL37。激活的固有免疫能够启动有效的获得性免疫。近年研究发现,与首次真菌感染的小鼠相比,二次白色念珠菌感染的小鼠角膜炎症减轻,愈合加快；血清中的免疫球蛋白水平增高,同时角膜中免疫球蛋白沉积和淋巴细胞浸润增多。这提示角膜真菌感染中,除了天然免疫,还启动了获得性免疫,两者之间的相互作用在眼部的急性和慢性炎症反应中发挥重要作用。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是获得性免疫反应中发挥重要作用的组分,刺激树突状细胞活化成熟,促进B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖和分化,启动获得性免疫的作用。迄今关于TSLP的研究多限于过敏性疾病,如哮喘、特应性皮炎,过敏性结膜炎等。目前在感染性疾病,特别是真菌感染中有关TSLP的研究甚少。Hideaki Kouzaki等发现,链格孢菌刺激人呼吸道上皮细胞能上调TSLP表达,但是TSLP是否参与角膜真菌感染,是否参与以及如何参与角膜真菌感染的获得性免疫仍不清楚。目的：研究烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞对胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin, TSLP)表达的影响,探讨外源性TSLP对Th2细胞分化的作用。研究烟曲霉菌感染角膜上皮细胞后TSLP表达对淋巴细胞增殖、活化及分化的影响,阐明TSLP在角膜真菌感染获得性免疫中的作用。方法：1.制备烟曲霉菌菌丝,使用购自中国典藏培养物保藏中心的烟曲霉菌菌株CCTCC 93024。菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基,培养24h后56。C加热60min灭活,研磨成20-40μm的片段于-80℃保存。2.培养人永生化角膜上皮细胞(Telomerase-immortalized human corneal epithelial cells),将培养的细胞随机分为两组：烟曲霉菌刺激组和空白对照组。实验组更换AF菌丝(106个/m1)刺激液,对照组更换F12/DMEM培养液。于不同时间点(1h,3h,6h,12h,24h,48h)收集细胞上清液,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TSLP的表达；3.密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),接种于六孔板上(1×106个/孔),随机分为实验组和空白对照组。实验组以重组人TSLP (1ng/ml)刺激,3d后收集两组的细胞及上清液。流式细胞术检测两组细胞中CD4+T细胞IL-4、IL-13的阳性率,ELISA检测细胞上清液中IL-4,IL-13的分泌,并进行统计学分析；4.利用transwell体系共培养PBMCs与THCEs。根据基因组数据库设计人TSLP的siRNA序列,采用siRNA干扰的方法抑制THCEs中TSLP表达。按照THCE处理方式的不同,设立对照组,烟曲霉菌刺激组,TSLP-siRNA+烟曲霉菌刺激组,阴性siRNA+烟曲霉菌刺激组。在siRNA转染24h后,分别更换F12/DMEM培养液,AF菌丝刺激液。于不同时间点收集上层的PBMCs(1d,2d,3d,5d,7d)及上清液(1d,3d,5d,7d)；5. CFSE染色检测PBMCs的增殖情况；流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞早期活化标志CD69的表达；RT-PCR检测PBMCs中IL-4、IL-13mRNA表达,胞内细胞因子染色检测CD4+T细胞IL-4/IL-13的阳性率；ELISA检测PBMCs上清中IgG、IgA水平。结果：烟曲霉菌刺激3h后,THCEs中TSLP的蛋白表达水平显著高于对照组；外源性TSLP刺激PBMCs,Th2型细胞因子(IL-4,IL-13)的分泌增多,CD4+T细胞IL-4、IL-13的阳性率显著提高。TSLP siRNA转染人角膜上皮细胞后,TSLPmRNA及蛋白水平表达均受到显著抑制。与对照组相比,烟曲霉菌刺激组的PBMCs中淋巴细胞增殖明显；CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞表面CD69表达显著升高,并于第2天达到最高水平；PBMCs中IL-4,IL-13mRNA表达增加,CD4+T细胞的IL-4,IL-13阳性率显著提高；收集的PBMCs上清中IgG、IgA水平升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。TSLP siRNA敲减THCEs表达TSLP,淋巴细胞的增殖、活化及Th2分化均受到抑制。此外,角膜上皮细胞分泌的TSLP促进B细胞产生IgG,而对IgA水平无明显影响。结论：烟曲霉菌菌丝刺激THCEs后,TSLP表达显著上调,外源性的TSLP能促进PBMCs中的CD4+T细胞向Th2方向分化。THCEs感染烟曲霉菌后产生的TSLP能促进T、B淋巴细胞增殖、活化,从而启动获得性免疫,并且能够诱导CD4+T细胞向Th2方向分化。此外,THCEs来源的TSLP增强B细胞介导的体液免疫。因此,TSLP是角膜抗真菌获得性免疫中的关键因素,表明TSLP可能是真菌性角膜炎治疗中的潜在靶点。