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便秘是临床常见疾病,目前流行病学调查显示,我国慢性便秘的发病率为6.07％,在老年人群可达到15％-20％。长期的慢性便秘不仅使患者生活质量下降,而且还成为结肠癌、乳腺疾病、肝性脑病、早老性痴呆等疾病发病的催化剂。便秘甚至可能诱发急性心梗或脑血管意外而直接危及生命。在各类慢性功能性便秘的患者中,慢传输型便秘的患者约占45％。慢传输型便秘发病机制复杂,病因不清,一直成为国内外学者研究关注的热点,也成为一项公认治疗难度较大的疑难杂症。因此要从根本上治疗慢传输型便秘,充分了解其发病机制是关键。本课题充分发挥中医药治疗便秘的优势,以导师总结的益气开秘方这一已经临床验证有效的经验方作为切入点,通过临床观察,并运用现代医学的组织病理学、生物化学以及分子生物学等手段,对益气开秘方治疗慢传输型便秘的作用机理进行定性、定量的研究,为进一步探讨慢传输型便秘的发生发展研究奠定基础。本研究通过动物及临床实验两部分以期对益气开秘方的有效性、安全性予以客观的评价,对其作用机制进行初步探讨。若疗效确实显著则可推广应用于临床,创造良好的社会和经济效益。
临床研究
目的:评价益气开秘方治疗慢传输型便秘的临床疗效,寻求其客观化、量化的疗效指标。
方法：通过前瞻性、随机、开放、阳性药物平行对照的临床试验,将60例慢传输型便秘患者随机分为两组,每组30例,观察组予益气开秘方水煎剂口服,对照组以莫沙必利片剂口服,4周为一疗程。观察治疗前后症状积分变化,生活质量量表积分变化,焦虑量表积分,血清NO、P物质变化,肠电图变化等项目指标。
结果：
1.经临床疗效观察进一步证实益气开秘方在治疗慢传输型便秘方面,疗效确切,益气开秘方观察组总有效率为73.33％,莫沙必利组总有效率为46.67％,观察组效果优于对照药物莫沙必利。各临床症状积分观察组与对照组治疗前后组内比较,差异有统计学意义(P＜0.01),治疗后,观察组对排便时间的改善程度明显优于对照组(P＜0.01),对于腹胀的改善优于对照组(P＜0.05)。
2.SF-36生活质量评分结果经统计学分析,观察组治疗前与治疗后比较、对照组治疗前与治疗后比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。
3.SAS焦虑量表评估结果经统计学分析,治疗后观察组与对照组两组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);两组治疗前后组内比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。
4.治疗前后血清NO含量经统计学分析,治疗后,观察组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);观察组、对照组治疗前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。血清SP含量经统计学分析,治疗后,观察组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);观察组、对照组治疗前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。
5.治疗前后肠电图升、降结肠振幅、频率结果经统计学分析,治疗后,观察组与对照组比较,降结肠振幅差异有统计学意义(P＜0.05),升结肠频率及降结肠频率差异均有统计学意义(P＜0.01);观察组与对照组组内比较,升、降结肠振幅、频率治疗后均较治疗前明显提高,差异均有统计学意义(P＜0.01)。
结论：研究表明益气开秘方治疗结肠慢传输型便秘疗效显著,能明显改善便秘临床症状,提高生活质量,缓解焦虑症状。益气开秘方具有调节肠道电活动的作用,其作用机制可能是通过调节NO、P物质等神经递质的平衡来恢复肠电活动。
实验研究
实验一:慢传输型便秘小鼠模型的制备
目的:复制及验证小鼠慢传输型便秘模型。
方法：选用三周龄balb/c清洁级小鼠60只,雌雄各半,随机分为四组,模型组、正常组及益气开秘方低剂量组(益气低组)、益气开秘方高剂量组(益气高组)。正常组不造模,其余各造模组(模型组、益气低组、益气高组)小鼠均皮下注射盐酸吗啡,2.5mg/(kg/d),共45天。每天观察其一般情况,记录精神状态、进食、活动和大便情况。以碳末推进试验验证造模是否成功,并观察该模型是否有性别差异。
结果：造模45天后60只小鼠均无死亡,此造模方法安全。正常组小鼠饮食、行为、活动、二便均正常。造模组小鼠食量变化不明显,活动减少,大便明显干结,呈圆珠状或串珠状。碳末推进率经统计学分析,正常组与造模组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。雌雄小鼠间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：吗啡诱导慢传输型便秘模型是可行的,盐酸吗啡皮下注射诱导的小鼠慢传输型便秘模型简便易行,安全可靠,重复性好。性别之间比较,雌雄小鼠模型肠道推进率无明显差异。
实验二:益气开秘方对STC模型小鼠结肠肌间神经丛NOS、VIP的影响
目的:免疫组化法探讨益气开秘方治疗慢传输型便秘的作用机理。
方法：分组及造模同实验一,正常组不给药,常规饲养。模型组:造模成功后,生理盐水灌胃,每日一次,每次0.4ml。益气开秘方低剂量组(益气低组):造模成功后,益气开秘方浓缩液稀释,按照《中药药理研究方法学》计算出中药人鼠等效剂量,15g/Kg/d灌胃,每日一次,每次0.4ml。益气开秘方高剂量组(益气高组):造模成功后,益气开秘方浓缩液稀释,30g/Kg/d灌胃,每日一次,每次0.4ml。灌胃两周后取材,制作切片,免疫组化法染色,镜下观察结肠肌间神经丛NOS、VIP的分布。
结果：
1.免疫组化染色后光镜下观察,四组小鼠结肠标本均有NOS的表达,主要分布于结肠黏膜下神经丛和肌间神经丛。NOS免疫组化指数(HIC-I)经统计学分析,模型组与正常组、益气低组比较,均有显著性差异(P＜0.01),与益气高组比较,有统计学差异(P＜0.05);正常组与益气高组比较有显著性差异(P＜0.01),与益气低组比较有统计学差异(P＜0.05);益气低组与益气高组比较,无统计学差异(P＞0.05)。
2.免疫组化染色后光镜下观察,四组小鼠结肠标本均有VIP的表达,主要分布于结肠黏膜下神经丛和肌间神经丛。VIP免疫组化指数(HIC-I)经统计学分析,正常组与其余三组比较均有显著性差异(P＜0.01),模型组与益气低组比较,有统计学差异(P＜0.05);与益气高组无统计学差异P＞0.05;益气低组与益气高组比较无统计学差异(P＞0.05)。
结论：盐酸吗啡诱导的慢传输型便秘小鼠模型中NO,VIP阳性表达的细胞减少,分布稀疏;益气开秘方干预后可对模型造成的NOS、VIP阳性神经纤维损伤有一定恢复作用,但未达到正常水平。
实验三:益气开秘方干预STC小鼠模型的Cajal间质细胞超微结构形态学观察
目的:观察各组中Cajal间质细胞的超微结构及其与平滑肌细胞的关系。
方法：动物及分组同实验二,共分四组,每组取4个标本,制作结肠肌层及部分黏膜下层电镜标本,于透射电镜下观察各组ICCs分布情况及其超微形态结构。
结果：四组模型中仅模型组未见Cajal间质细胞,其余三组均可观察到Cajal间质细胞,其形态学特征为:Cajal间质细胞均见于结肠组织肌层及肌间层,与平滑肌细胞相邻,有完整的细胞膜,细胞核较大,细胞器多集中于细胞核两端,大量线粒体及发育良好的高尔基体,内质网发达,有较多中间丝,无粗肌丝,接近三级神经束;ICCs相互之间、与平滑肌细胞间可见缝隙连接。
结论：益气开秘方中药干预慢传输型便秘小鼠对其结肠内ICCs的数量、形态结构及胃肠神经-ICC-平滑肌网络结构均有保护或恢复作用。
实验四:益气开秘方对模型小鼠C-kit mRNA及C-kit蛋白表达的影响
目的:分子生物学水平研究益气开秘方对慢传输型便秘的影响机理
方法：取材动物同实验二,将取材组织置于液氮罐中冷冻保存待用。以Real-time PCR、Western-blot分别检测各组小鼠C-kit mRNA及C-kit蛋白表达情况。
结果：1.通过RT-PCR法测定小鼠结肠C-kit mRNA表达,其相对含量经统计学分析,模型组与其余三组均有显著性差异(P＜0.01);正常组与益气低组比较,无统计学差异(P＞0.05),与益气高组比较有显著性差异(P＜0.01);益气高组与益气低组间比较有显著性差异(P＜0.01)。
2.通过Western-blot法测定小鼠结肠C-kit蛋白表达,经统计学分析,结果表明模型组与正常组比较,有显著性差异(P＜0.01),与益气低组比较,有统计学差异(P＜0.05),与益气高组比较无统计学差异(P＞0.05);正常组与益气低组比较,无统计学差异(P＞0.05),与益气高组比较,有统计学差异(P＜0.05);益气低组与益气高组比较,无统计学差异(P＞0.05)。
结论：
1.通过Real-time PCR检测C-kit mRNA基因表达显示,慢传输型便秘模型小鼠结肠组织中C-kit mRNA基因表达量明显减少,益气开秘方干预模型后其表达量有一定恢复,且低剂量组效果更好,接近正常水平,提示益气开秘方对慢传输型便秘小鼠C-kit基因具有良好的恢复作用。
2.通过Western-blot检测C-kit蛋白表达显示,慢传输型便秘模型小鼠结肠组织中C-kit蛋白表达量明显减少,益气开秘方干预后其表达量有一定恢复,但未恢复至正常水平,提示益气开秘方对慢传输型便秘小鼠C-kit蛋白表达具有一定的恢复作用。实验五:益气开秘方干预的慢传输型便秘模型小鼠Cajal间质细胞的培养及[Ca2+]I测定
目的:体外培养Caial间质细胞,观察益气开秘方干预动物模型后培养的细胞生长情况,探讨益气开秘方的作用通道。
方法：三周龄左右balb/c小鼠随机分成三组,正常组,模型组,益气开秘方,造模方法同实验一,造模后模型组予生理盐水灌胃,0.4ml,每日一次,中药组予益气开秘方灌胃,15g/Kg/d剂量,0.4ml,每日一次,各组造模后次日起给药,四周后取材。采用优化酶解法分离Caial间质细胞,观察细胞形态,生长周期及规律,比较益气开秘方干预后的模型组小鼠分离培养的Cajal间质细胞生长情况,并予免疫荧光染色鉴定细胞;用Fluo-4AM标记细胞,激光共聚焦显微镜下检测细胞内[Ca2+]I变化,并观察外源性NO干预后细胞内[Ca2+]I变化情况。
结果：
1.成功分离培养出小鼠小肠Cajal间质细胞,经C-kit免疫荧光鉴定,Cajal在体外培养成功。体外培养Cajal间质细胞的生长规律为:正常组、模型组、中药组三组分离接种好的Cajal间质细胞于24 h内均可贴壁,细胞呈三角形或梭形,有少量短突起。体外培养3天后即可形成较长的长突起,并与周围细胞形成突触连接,7天左右Cajal间质细胞间的突起可相互连接成复杂的三维网络连接。7天后模型组胞体出现深色颗粒,网络结构局部断裂,正常组及中药组细胞生长状态良好,细胞间突起网络连接正常。培养14天左右,模型组细胞胞体见大量颗粒,胞体固缩,细胞间连接断裂、消失。正常组及中药组中部分细胞出现少量深色颗粒,细胞间连接局部断裂。
2.通过激光共聚焦显微镜观察及[Ca2+]I测定,体外培养ICC细胞具有钙振荡功能:外源性NO干预后细胞内[Ca2+]I明显增强。
结论：
1.吗啡诱导的STC小鼠模型中主要发生的病理变化是ICC数量的减少或结构上的破坏,益气开秘方干预后培养的Cajal间质细胞生长周期与正常组小鼠相近,明显长于STC小鼠细胞,益气开秘方能够减轻和修复吗啡诱导的STC小鼠小肠ICC损伤,恢复ICC数量。
2.益气开秘方对吗啡诱导的慢传输型便秘小鼠具有一定肠动力恢复作用。其作用可能通过增加NOS表达,促进NO的释放,发挥NO对ICC细胞保护作用,对ICC的调控作用与NO-cGMP途径有关。