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血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染病,也是我国目前面临的重要公共卫生问题之一。湖北钉螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸虫唯一的中间宿主,在日本血吸虫病传播过程中起着关键作用。湖北钉螺分布于我国大陆长江中下游及以南的湖沼、山丘和高山地区,由于受地理隔离的严重应影响,以及孳生环境、自然因素的差异,湖北钉螺不同地理群体间发生了显著的遗传分化。鉴于其对血吸虫病流行病学研究、血吸虫病预防控制工作的重大意义,湖北钉螺遗传多样性的研究得到了广泛的关注,但相对现代生物信息技术的快速发展,湖北钉螺遗传多样性的研究仍显不足,研究手段极不丰富。本研究首先通过采集不同景观地区的湖北钉螺样本,建立湖北钉螺空间分布数据库,在此基础上应用基因组DNA的酶切片段与生物素标记的(AAT)17,(GA)25, (CCT)17,(AC)25,(CAG)17,(CA)18, (CAC)5, (TC)10, (GT)8和(TG)1 8等寡核苷酸探针杂交、分离、富集和克隆测序,完成湖北钉螺微卫星DNA库的构建,并据此挑选具有多态性的微卫星位点,对长江中下游地区的湖北钉螺群体的遗传结构进行了分析；应用长PCR技术和引物步移测序技术,结合SubPCR和克隆测序策略,测定湖北钉螺湖南岳阳株的线粒体基因组(mtDNA)全序列,并通过测定不同景观群体湖北钉螺个体线粒体基因(16S)和核糖体间隔区(ITS1--ITS2)片段序列,综合分析了湖北钉螺不同景观群体遗传分化和地理隔离之间的关系。为此,本研究获得以下结果：一、湖北钉螺空间遗传信息管理系统的构建1.基于景观遗传学的理念,以湖北钉螺空间分布研究、种群遗传学研究为目的,在初步收集了湖北钉螺不同地理景观群体基础上,利用计算机语言设计、编制了湖北钉螺空间遗传信息管理系统。该系统总体结构包括了两个部分,一是基础数据库,二是管理系统,其中基础数据库根据研究样本的分类层次划分为三个数据库,分别是采集点数据库、样本数据库和遗传信息数据库。2.初步完成数据库的构建,包括了73个采集点、676条记录及其相关遗传信息。管理系统安全稳定,通过二次编码和有效索引,可以实现对数据的查询、筛选、修改、导入和导出功能,便于管理和操作.该系统可以为各类地区的钉螺特征提供查询服务,为研究设计和统计提供方便,因此,对湖北钉螺分布和群体遗传研究具有一定的应用价值。二、基于微卫星DNA的湖北钉螺遗传多样性研究1.首次构建了湖北钉螺微卫星DNA库。共获得了209条微卫星DNA序列,经远程blast检索显示,与已知的微卫星DNA序列无明显的同源性。所获得的微卫星DNA序列中,完整重复序列79条,占37.8%,非完整重复序列101条,占48.33%,复合重复序列有29条,占13.88%；微卫星DNA序列中以双核苷酸重复占多数,三核苷酸重复序列重复次之,多核苷酸重复比较少见；重复序列以(CA)n和(GT)n数量最为丰富,重复次数最多的(CA)n可达98次。2.筛选并描述了微卫星DNA库中的部分多态位点。按照微卫星DNA分类原则,筛选了67个微卫星位点,并对其中20个位点进行了鉴定。有16对引物有明显的特异性扩增,其中14个位点具有多态性,多态性比例为70%。随机挑选7个位点进行湖北钉螺群体基因扫描,有6个位点可以获得良好的信号,即P84,T5-13,T5-11,T4-22,T6-27和P82。6个微卫星DNA位点中,除P84位点的观测杂合度和PIC值较低,分别为0.1667和0.1813,其余位点的观测杂合度和PIC值范围在0.36-0.8929和0.8437-0.9289间,具有较好的多态性。3.应用6个微卫星位点检测对长江中下游5个湖北钉螺群体的群体遗传结构。6个微卫星DNA位点中,共检测到188个等位基因,不同位点在群体间平均为15.83个；等位基因在不同群体中的分布无明显的集中趋势。群体内遗传分析显示,所有位点平均的观测杂合度、期望杂合度和PIC值分别为0.637、0.811和0.777,多态性明显,综合所有指标的信息,湖北群体遗传变异程度最高,江苏群体最低。群体间遗传结构分析表明,江苏和江西群体间具有较高的遗传分化程度,安徽与湖南群体间则分化程度较小。总群和群体内基因交流不高,因而杂合度较高；然而群体间分化系数表明群体间分化较低,遗传变异主要来自群体内的个体间。三、基于线粒体基因组的湖北钉螺遗传多样性研究1.首次获得的湖北钉螺线粒体基因组全序列。湖北钉螺线粒体基因组全序列全长15 182 bp (Genbank登记号：FJ997214),为闭合环状分子,A+T含量为67.32%。共编码37个基因,包括13个蛋白基因、22个tRNA基因、2个RNA基因和一段A+T富集区,其中轻链编码8个tRNA基因,其余基因由重链编码。2.对线粒体DNA全序列进行生物信息学分析。13个蛋白质编码基因均以ATG为启动子,以TAA或TAG为终止子,其中ND1以潜在的丁作为终止密码子,所有编码蛋白基因转录方向相同,密码子的碱基使用较强的AT偏好。线粒体基因组间隔区共21处合计145bp,长度范围为1-30bp,最长的间隔区为30bp；基因重叠区较短,且仅2处,分别为4bp和7bp。线粒体基因组含有22个转运RNA,除2个tRNASer (AGN)和tRNAGln、tRNAIle以外都能形成典型的三叶草结构,且存在一个特有的tRNA (tRNASeC)。3.基于核糖体DNA的ITS1-ITS2和mtDNA-16S基因序列分析湖北钉螺不同景观群体遗传多样性。不同的DNA分子序列的遗传特征将我国大陆湖北钉螺群体可分为4个主要类群,即长江中下游地区群体、云南和四川的高山型群体、广西内陆山丘型群体和福建沿海山丘型群体,2个DNA分子(ITS1-ITS2、16S)在不同采集点之间的遗传差异呈明显的地理聚集性,并与地理距离之间形成显著的相关性(P<0.001),相关指数分别为RITS1-ITS2=0.784,R16S=0.717,群体遗传分布格局符合距离隔离模型。