论文部分内容阅读
本文在以往研究的基础上，通过建立低浓度苯以及苯－甲醛长期吸入暴露的亚慢性毒性动物模型，探讨低浓度苯、甲醛长期暴露可能存在的致白血病作用，以及甲醛与苯是否在白血病发生中具有联合作用。
鉴于苯、甲醛本身的健康危害性，确定苯、甲醛暴露易感基因型将有助于对高危人群的筛检与保护。本课题采用EB病毒转化法构建汉族永生化淋巴细胞库，结合对单核苷酸多态性数据库检索与分析，用适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增法对苯、甲醛关键代谢酶基因转录起始位点上游和编码区等进行多位点SNPs分型；在对细胞进行苯、甲醛等代谢底物标准化诱导后检测与比较基因表达和酶活性水平和遗传毒性的变化；通过基因结构－功能－效应相关性的生物信息学分析后筛检出功能SNPs，获得苯、甲醛暴露高危人群的SNPs遗传标记。继而进一步经白血病流行病学研究，确定与苯、甲醛代谢相关的汉族白血病易感性遗传标记。
1．室内装修致苯、甲醛空气污染及人群白血病发生危险性的研究
本研究对2005年7月～12月南京市新建成小区17户新装修住宅的室内苯系物和甲醛浓度进行了动态监测，并对其相应的装修状况及室内人群健康进行了调查分析。
结果提示装修后3个月内入住存在苯系物暴露的风险，暴露风险随时间而降低；装修后6个月间入住存在较高的甲醛暴露的风险，暴露风险随时间而降低。伴随装修后上述时期内普遍的苯、甲醛暴露，此阶段入住的被访者100％嗅到异味，并有75％的主诉有各种不适感，虽然症状以呼吸系统和皮肤过敏为主，但可能是更严重的健康危害的预警。
2．低浓度苯、低浓度苯与甲醛联合吸入对小鼠的亚慢性毒性作用研究
以装修主要污染物苯及苯、甲醛联合对BALB/C小鼠进行吸入染毒，并继续饲养90d，观察其亚慢性毒性、遗传毒性、造血系统损伤、抗细胞凋亡通路的变化以及停止染毒后的蓄积作用，系统地探讨低浓度苯，及苯、甲醛长期联合暴露的健康危害效应。
观察结果：低浓度苯，苯、甲醛长期联合吸入染毒后，小鼠出现皮毛散乱、精神不振等中毒症状，且苯、甲醛联合吸入暴露组小鼠的中毒症状出现较早，停止染毒后小鼠的中毒症状持续存在；组织病理学检查表现为染毒组部分小鼠出现肺脏、肝脏及脾脏病理性改变，肺部表现为水肿、充血、炎症、脓肿，肝脏表现为水肿、充血、灶性病变，脾脏表现为巨细胞浸润；遗传毒性观察结果显示染毒10d、30d、90d后小鼠外周血网织红细胞的微核率和彗星率较阴性对照组明显升高，且苯、甲醛联合暴露组的微核效应和彗星效应更明显，联合吸入染毒结束90d后，小鼠外周血淋巴细胞的微核率和彗星率仍显著高于阴性对照组；三系造血和骨髓检测显示低浓度苯，苯、甲醛长期联合暴露可导致造血干细胞的异常分化及病态造血，引起小鼠贫血和造血系统恶性克隆性疾病骨髓增生异常综合征，本次研究未见白血病小鼠的出现；抗细胞凋亡因子检测显示低浓度苯，苯、甲醛联合吸入染毒结束90d后，小鼠血浆核转录因子NF－κB和抗凋亡基因bc1-2表达显著升高，各染毒组间的变化无统计学差异。
以上结果提示低浓度苯，苯、甲醛长期联合吸入暴露可以导致小鼠健康危害，对肺脏、肝脏等造成病理性改变：对染色体和DNA具有不可逆的损伤作用，且苯和甲醛之间可能存在协同作用；可导致造血干细胞的异常分化及病态造血，存在造成血液系统恶性克隆性疾病发生的可能性；可诱导NF-κB活化、Bc1－2高表达，抗细胞凋亡通路被激活，可能导致突变细胞正常凋亡障碍，提示抗细胞凋亡通路的激活可能是造血干细胞恶变的机制之一。
3．汉族人群代谢酶基因分型永生化淋巴细胞库的建立
以EBV加环孢霉素A转化人外周血淋巴细胞的方法所建立的96株汉族永生化淋巴细胞株，其中男性51株，女性45株，年龄18-60岁。该细胞株成功转化建立的标志是细胞聚集成团并悬浮生长。本研究中的成功转化率大于80％。该细胞库用以建设汉族SNPs基因分型的永生化淋巴细胞库，为SNPs结构-功能的研究提供新的思路和技术平台。
用ALM-ASA方法对MPO的9个SNPs位点进行了基因分型，先期检测40个样本，经测序和限制性片段长度多态性分析方法验证，结果高度符合，证明该法用于同时测定多个位点的SNPs可靠性。为进一步探讨在大样本人群研究中的可行性，将ALM-ASA多重扩增技术引入MPO多位点SNPs与急性白血病危险性关系的病例对照的研究中，用该法检测了病例组和对照组MPO的9个SNPs位点的基因分型，结果用SHESIS软件进行了连锁不平衡分析，构建了单倍型，通过多位点分析筛检发现MPO在汉族人群启动子区有3个多态位点存在，在外显子2有1个多态位点存在。连锁不平衡检验发现-1816T/-586 T和-1816C/-586C完全连锁遗传。分析基因型与单倍型在两组间的分布提示MPO-463独立的影响白血病的发生，携带MPO－463位点突变基因型的个体，可能降低白血病的发生。ALM-ASA多重扩增技术在该研究中的成功应用，也证明该法用于同时测定多个位点的SNPs可靠、可行，是适合基层推广的方法之一。
通过对本研究中所构建的汉族永生化淋巴细胞库进行CYP2E1、NQO1、ADH5三个苯、甲醛代谢关键代谢酶进行基因分型，获得不同基因型的细胞株。检测位点的确定是通过查询NCBI dbsnp，筛检位于转录起始点上游区域和编码区的SNPs位点，选择其中亚洲人群SNPs突变基因型大于5％的位点；若亚洲人群在此两区域无SNPs，则在非翻泽区和内含子区域区扩展筛检范围。基因分型根据各位点的特点分别采取ALM－ASA，PCR－RFLP和测序的方法。其中本研究中获得的CYP2E1汉族人群特异性SNPs位点有rs3813866， rs2031921，rs2070673，rs2031920，其突变频率分别为25．00％、21．67％、37．04％、29．13％。NQO1汉族人群特异性SNPs位点有rs180056、rs10517，其突变频率分别为40．7％、40．0％。ADH5汉族人群特异性SNPs位点有rs1154409、rs2870619、rs1154414，其突变频率分别为32．35％、12．50％、37．5％。
4．苯、甲醛关键代谢酶的功能SNPs分析
采用自行构建的汉族永生化人淋巴细胞系，应用苯的中间代谢产物苯酚对永生化淋巴细胞进行诱导，分析比较CYP2E1 rs2070673、rs2031920、rs2031921、rs3813866 SNP4个位点不同基因型与底物诱导的mRNA表达、酶活性表达和DNA损伤之间的关系，结果表明CYP2E1 rs2070673TT基因型，rs2030920CC基因型可在转录水平上调控基因高表达而提高酶活性，其中携带CYP2E1 rs2030920CC基因型的细胞可能对苯酚的遗传毒性更敏感。研究结果提示了CYP2E1 rs2030920、CYP2E1 rs2070673可能是苯代谢功能相关的SNPs位点。
采用自行构建的汉族永生化人淋巴细胞系，应用苯的中间代谢产物苯醌对永生化淋巴细胞进行诱导，分析比较NQO1 rs1800566、rs10517SNPs2个位点不同基因型与底物诱导的mRNA表达、酶活性表达和DNA损伤之间的关系，初步探讨了上述不同位点基因型对基因功能的影响，结果位于编码区的NQO1 rS1800566T突变基因型降低了所编码的酶活性，该基因型细胞株对苯醌的遗传毒性更敏感。结果提示NQO1 rs1800566可能是苯代谢功能相关的SNPs位点。
采用自行构建的汉族永生化人淋巴细胞系，应用甲醛对永生化淋巴细胞进行诱导，分析比较ADH5内含子rs28730619、rS1154414、rs1154409 SNP位点不同基因型是否影响底物诱导的mRNA转录水平而影响基因的功能，结果提示ADH53个内含子突变未能影响ADH5的mRNA表达水平的改变，对该基因的转录活性没有影响。
5．苯关键代谢酶SNPs与汉族白血病高危险人群遗传标记的流行病学研究
本文用本实验室构建的永生化淋巴细胞库，对汉族苯、甲醛关键代谢酶种族特异性的SNPs位点基因分型，通过研究化合物－基因型－功能－效应之间的关系，确定了汉族人群苯关键代谢酶CYP2E1 rs2030920、rs2070673，NQO1 rs18005663个SNP位点，通过人群病例-对照研究，筛检此3个SNsP位点的不同基因型是否影响苯装修与职业暴露对白血病发生的危险性。
结果提示表明CYP2E1 rs2030920SNP基因型与成人急性白血病的易感性相关，携带CYP2E1 rs2030920CC野生基因型者，患成人急性白血病的危险度是携带突变基因型的1．69倍，将该基因型与苯的装修和职业暴露史作交互作用分析时，发现当有苯装修或职业暴露史时，携带CYP2E1 rs2030920CC野生基因型者，患成人急性白血病的危险度是携带突变基因型的2．01倍，无暴露史时，携带CYP2E1 rs2030920CC野生基因型者，患成人急性白血病的危险度是携带突变基因型的1．31倍，交互作用分析，差异有统计学意义，提示暴露苯的同时携带CYP2E1 rs2030920CC野生基因型者比携带突变基因型者向血病发生的危险性高。