蒲公英酶解活性肽的研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:larrytangliang
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蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)具有清热解毒、消肿散结、利尿利胆、消炎散结等药用功效。现代药理研究表明,蒲公英具有抗真菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用,其主要活性成分为黄酮、多糖、蛋白质等。为拓展蒲公英蛋白肽在抗菌肽、抗氧化肽新药和保健食品开发领域的应用,弥补蒲公英寡肽研究方向的空缺,本课题以蒲公英根为原材料进行全成分活性分析、蛋白提取工艺、酶解肽及蛋白质不同分子量组分活性分析、酶解工艺、LC-MS分析几个方面依次进行了研究,具体结果如下:以蒲公英干燥根为研究对象,利用系统溶剂法对蒲公英不同极性组分进行活性筛选,用纸片抑菌法考察不同极性组分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用,同时以羟基自由基清除率为指标考察不同极性组分的抗氧化活性。结果表明水层对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活性作用明显,且水层稍强于其他组分,各组分对枯草芽孢杆菌均无抑制作用。乙醇层与水层抗氧化活性最佳分别为63.14%和61.21%。以提取温度、提取时间、料液比为基本因素对蒲公英根蛋白质进行水提取,在单因素试验的基础上建立了正交试验并获得最佳工艺参数为提取时间120min,提取温度为30℃,料液比为1:30。经试验证明,此条件下水提液蛋白质含量为13.88%。运用超滤膜技术,对蒲公英水提物进行超滤分级,选用1KDa,3KDa,10KDa超滤膜,将提取液中蒲公英蛋白质分级为大于10KDa、3-10KDa、1-3KDa、小于1KDa组分,并酶解大于10KDa组分后将酶解溶液过1KDa超滤膜获得酶解寡肽组分,通过对各组分的抑菌活性和抗氧化活性的对比试验,结果表明各组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制活性顺序为酶解寡肽>小于1 KDa>1-3 KDa>3-10 KDa>大于10 KDa>空白对照,酶解寡肽组分、小于1 KDa组分样品的抑菌圈均有显著性(P<0.05),羟基自由基清除率顺序为酶解寡肽>小于1 KDa>3-10 KDa>1-3 KDa>大于10 KDa。考虑到蒲公英小于1KDa组分寡肽含量较少,而大分子蛋白质含量相对较多,所以本课题利用酶解法制备酶解肽并筛选出最佳酶解工艺,以酶解温度、酶底比、pH值、时间为基本因素,在单因素试验基础上,利用响应曲面法最终获得最佳酶解工艺参数为:酶解温度37℃,酶解时间为4h,pH值1.8,酶底比5%,多肽含量预测响应值为6.68%,水解度预测响应值为47.09%。各因素对酶解效果的影响程度选择为:温度>酶底比>pH值>时间。为进一步确定蒲公英抗菌、抗氧化活性成分基础,使用凝胶柱对蒲公英天然寡肽进行分离纯化,通过薄层色谱法鉴别含有氨基酸类馏分合并备用,结合液质联用技术对蒲公英天然寡肽和酶解寡肽进行结构解析,分别推断分析得到6种寡肽,推测天然寡肽结构可能为:寡肽PGYGT-T1的结构为NH2-Asp-Val-COOH,寡肽PGYGT-T2的结构为NH2-Asn-Glu-COOH,寡肽PGYGT-T3的结构为NH2-Val-Arg-COOH。酶解寡肽结构可能为:寡肽PGYGT-M1的结构为NH2-PHe-Lys-COOH或NH2-PHe-Gln-COOH,PGYGT-M2的结构为NH2-His-Cys-COOH,PGYGT-M3的结构为NH2-Val-Arg-COOH。本课题为蒲公英抗菌肽、抗氧化肽产品开发提供参考,为蒲公英寡肽在植物肽新药开发领域提供理论基础。
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