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银屑病是常见的慢性炎症性皮肤病,全球范围内大约有1.25亿人群患有银屑病,严重影响患者生活质量和心理健康[1]。银屑病发病机制复杂,过度活跃的适应性免疫应答在其中发挥重要作用,包括Th1/Th17为核心的适应性免疫紊乱[2],以TNF-α、IL-23、IL-17为主的效应细胞因子的分泌[3]。其中,IL-17是银屑病发病机制中的关键分子,临床上靶向IL-17的药物也获得了很好的疗效[4]。IL-17主要由TH17/CD8+T[5]、固有免疫淋巴细胞ILC3（innate lymphoid cells）[6]、肥大细胞[7]、中性粒细胞[8]等产生。TH17是IL-17的主要来源[9],初始CD4+T细胞通过TCR受体识别抗原提呈细胞呈递的抗原肽（第一信号）,以及协同刺激分子（第二信号）的共同作用下,在一定的细胞因子环境下,如IL-23、IL-6、TGF-β、IL-1β存在下,CD4+T细胞就会向TH17细胞分化[10]。IL-23/IL-17轴在银屑病中发挥重要作用[11]。DC细胞受到自身抗原（如LL37）[12]或其他微生物（如真菌）[13]的刺激分泌IL-23,IL-23与其受体结合促进JAKs通路的磷酸化,进而促进ROR-γt和STAT3的转录[14,15],使CD4+T细胞分化为TH17,分泌IL-17A、TNF-α、IL-22,从而形成正反馈回路。环境因素对银屑病的发生发展有着重要的影响,如感染、吸烟、喝酒等。过度饮酒会加重银屑病,并且增加银屑病患者焦虑抑郁的风险[16]。体外研究发现酒精及丙酮能够诱导角质形成细胞的增殖,破坏皮肤屏障[17];在角质形成细胞与T细胞系共培养的模型中,酒精能够促进炎症因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达,诱发TH1反应[18];慢性饮酒加重银屑病小鼠模型的皮损,并且增加了IL-17m RNA的表达[19]。在一项肺纤维化的研究发现酒精能够诱导TH17的分化,而具体的机制还未明确[20]。TH17分化过程中,除了特定的细胞因子环境,还需要能量代谢的重调,比如糖酵解[21]、谷氨酰胺代谢[22]、脂肪酸代谢[21]的升高等。因此,调控能量代谢也成为治疗自身免疫性疾病治疗的新靶点。TH17分化过程中偏向糖酵解代谢的现象,又称为沃堡效应（Warburg effect）[21]。沃伯格博士最初在大多数癌细胞中观察到这种现象,即使在氧气浓度充足的情况下也会出现。丙酮酸激酶2（PKM2）作为糖酵解的限速酶,参与许多肿瘤的发病过程[23]。此外,PKM2还可以通过调控许多转录因子,如低氧诱导因子HIF-α、STAT3的磷酸化,发挥生物学功能[24]。PKM2在大多数癌细胞中表达都上调[25],在银屑病皮损中表达也上调[26]。并且,近年来研究发现PKM2可以调控TH1/TH17的分化[27]。因此,PKM2成为肿瘤及自身免疫性疾病治疗的新靶点。鉴于IL-17/TH17在银屑病发病机制中的重要意义,本次研究以咪喹莫特为银屑病小鼠模型,体外诱导TH17分化为细胞模型,研究酒精对银屑病及IL-17、TH17分化的影响,并且进一步从能量代谢的角度,探究TH17升高的相关机制。我们发现酒精能够促进TH17分化,并且增加PKM2的表达。紫草素是PKM2的抑制剂,在之前的很多研究中,发现紫草素能够改善咪喹莫特诱导的银屑病小鼠皮损[26,28-30]。本次实验进一步研究紫草素对酒精加重的咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的作用。研究方法:本实验分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验分为两部分,一部分是酒精对咪喹莫特银屑病小鼠模型的影响,另一部分是紫草素对饮用酒精的咪喹莫特银屑病小鼠模型的作用。第一部分用6-8周BALB/c小鼠（18-20g）,饲养一周后（20-22g）,随机分为6组:空白组、模型组、不同浓度酒精组（20%、30%、40%、50%）。除空白组外用凡士林外,其余各组以外涂62.5mg/d咪喹莫特造模,连续7天。不同浓度的酒精用无菌dd H2O配制,以灌胃的方式给予,空白组和模型组灌胃同等剂量的无菌dd H2O。7天后,每组各处死6只小鼠,取皮损、脾脏及眼球血。皮损进行HE染色及免疫组化检测。外周血进行ELISA检测相关炎症因子的表达。用流式检测脾脏中CD4/CD8/IL-17的表达。WB检测皮肤和脾脏中IL-17及相关蛋白的表达。之后,20%酒精组分为连续灌胃酒精组和灌水组。于第10天用环钻取皮肤组织。其余组小鼠继续灌胃酒精或水至第14天处死小鼠,取皮损进行HE染色。第二部分BALB/c小鼠分为四组,模型组、20%酒精组、20%酒精加紫草素组和单纯紫草素组,每组各六只,紫草素用DMSO溶解至所需浓度20mg/ml,再用食用油溶解至所需浓度10mg/ml。模型组予含5%DMSO的植物油和200ul dd水灌胃。酒精组给予等量含5%DMSO的食用油及200ul 20%酒精灌胃。酒精加紫草素组予10mg/kg紫草素及200ul 20%酒精灌胃。单纯紫草素组每只小鼠给予10mg/kg紫草素及200ul dd水灌胃。相机拍照,进行PASI评分,于第6天处死小鼠,取皮损和眼球血。皮损进行HE染色。外周血进行ELISA检测IL-17的表达。细胞实验采用体外磁珠分选提取CD4+T细胞,体外诱导分化为TH17,加入酒精和（或）紫草素。敷育48h后,用PMA+离子霉素刺激4-6小时,收集细胞及上清,流式检测TH17的比例,ELISA检测上清中IL-17的表达。WB检测相关蛋白的表达。结果:1)酒精能够加重银屑病小鼠模型的表型及延缓皮损的消退,增加炎细胞的浸润,增加炎症因子的表达。模型组小鼠背部皮肤表现出红斑、鳞屑、增厚,在涂药第六天达到高峰,但在涂药第7天后,皮损开始消退。高浓度酒精组（40%、50%）小鼠出现醉酒状态（昏睡）,并在实验过程中死亡。与模型组相比,酒精组（20%、30%）出现红斑、鳞屑、增厚早,且鳞屑消退较慢。第7天HE染色显示酒精组表皮厚度增加。免疫组化结果显示与模型组相比,酒精组表皮CD3阳性细胞浸润增加,IL-6、HIF-α、VEGF表达增高。2)酒精能够增加皮损中PKM2-TH17通路中相关蛋白的表达,增加脾脏中TH17的表达。RT-PCR、WB及ELISA结果显示酒精组皮损、血清中IL-17A表达增高。与模型组相比,酒精组脾脏中TH17比例增高,且PKM2表达也升高。皮损中PKM2、STAT3的表达也增高。3)体外实验发现酒精能够促进TH17的分化,加入紫草素后能下调TH17的分化,降低PKM2的表达。4)紫草素能够缓解饮酒后的咪喹莫特银屑病小鼠模型皮损,降低IL-17A表达。结论:酒精能够加重咪喹莫特诱导的银屑病样皮损,增加炎细胞浸润,增加炎症因子的分泌。酒精能够促进TH17分化,增加IL-17A的表达。紫草素可以通过PKM2/TH17通路缓解酒精加重的咪喹莫特诱导的银屑病样皮损。