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癌症是全球范围内非常重要的公共健康问题。长期以来,前列腺癌被认为是欧美国家男性中最常见的恶性肿瘤,然而,在我国,随着人们平均寿命的延长、人口的老龄化的加剧,前列腺癌的发病率也逐渐增高,因此有效地防治前列腺癌是我国亟待解决的一个公共卫生难题。在现阶段,前列腺癌的治疗方法主要有手术切除、雄激素去势治疗、放疗、化疗;但是,这些手段通常仅在起始阶段有效,最终多数患者对这些传统的治疗都产生抵抗,发展为广泛转移。多年来,针对前列腺癌的基础研究并没有为治疗和预后带来突破性的进展,需要从新的角度寻找特异性的治疗药物和方法,这有赖于从不同的角度了解和掌握前列腺癌发生发展的机制。肿瘤的发生发展是一个动态而复杂的过程,目前研究者普遍认为:恶性肿瘤中含有的肿瘤干细胞样细胞是维持肿瘤生长的主要因素。肿瘤干细胞是肿瘤组织内含有的一小部分肿瘤细胞,其特性与干细胞类似,表现出能够自我复制和更新的能力,可以进行一定程度的分化。自1990s年加拿大的肿瘤研究者Dick在白血病中鉴定出肿瘤干细胞之后,不断有研究者通过各种手段在包括脑、乳腺、结肠、前列腺、胰腺等不同来源的肿瘤中检测出肿瘤干细胞的存在,日益增多的证据表明:肿瘤干细胞极有可能是癌症复发、转移的根源,如何有效地和特异性地杀灭肿瘤干细胞是当前肿瘤研究领域的一大挑战。因而,充分了解肿瘤干细胞的性质、特征,从而通过靶向维持肿瘤干细胞的调控途径,达到有效杀灭肿瘤干细胞最终根治癌症的目的。近年的研究发现,正常干细胞特性的维持不但包括了表观遗传层次的修饰,同时也需要细胞内代谢模式转化的协同参与。但是对于肿瘤干细胞代谢特征,现阶段我们了解得远远不够。对正常干细胞能量代谢模式中的研究可以为我们提供思路,研究发现胚胎干细胞,造血干细胞,间充质干细胞以及诱导的多能干细胞(i PS)在不同的生理状态下,有不同的代谢模式,体现在:这些干细胞中的线粒体氧化磷酸化水平低下,细胞更多地依赖糖酵解途径进行生存。这种代谢模式目前被认为是维持细胞干性特征的必要因素;相反,当这些干细胞的代谢模式从糖酵解为主转变为以氧化磷酸化为主时,通常认为是干细胞起始分化的标志。这个理论目前可以很好地在各种干细胞培养和实验中得到验证,同时i PS的诱导过程可以为我们在肿瘤干细胞研究中带来更深的启发。我们知道,i PS细胞的本质是对已分化的成体细胞进行基因编辑,以期恢复细胞分化的全能性。研究发现,这些终末分化细胞的代谢方式主要是线粒体介导的氧化磷酸化;然而当在这些终末分化的细胞中导入干细胞四因子(Sox2、c-Myc、Oct3/4、Klf),细胞去分化,重新获得分化潜能,同时其代谢方式也被同步转换为糖酵解。由于这些细胞表现出在常氧条件下的嗜糖酵解特性,因此这种特性有时也被称作做有氧糖酵解(Aerobic Glycolysis),而这些细胞内总体代谢框架的改变也被称为代谢重编程(Metabolic reprogramming)。现阶段的研究发现,细胞干性重编程的过程偶联了代谢重编程,尽管表观遗传修饰在这个过程中处于核心位置,但是大量的实验室研究强烈提示:代谢的可编程性是细胞重获多潜能的先决条件。同时研究人员已经发现,将已分化的细胞暴露于低氧或者抑制其氧化磷酸化将有助于提高干性的重编程的效率;相反,通过刺激干细胞中的线粒体功能发育或者抑制糖酵解将会显著提高ATP的产量并促进干细胞分化。有趣的是,根据文献记载,代谢重编程最早并非在干细胞中被发现,而是在高度恶性的腹水肿瘤细胞和肝癌组织中首次被记录,早在1924年,一名叫Warburg的德国科学家发现,他所使用的小鼠腹水肿瘤细胞和大鼠肝癌组织即便在氧气充足的情况下,仍然主要依靠糖酵解进行葡萄糖代谢提供能量,这些由葡萄糖分解产生的丙酮酸大部分经乳酸脱氢酶转化为乳酸而排出细胞外。后来的研究发Warburg在文献中描述的现象的本质即有氧糖酵解,为了纪念Warburg的杰出贡献,细胞进行有氧糖酵解的现象也被称作为Warburg效应(Warburg effect。近90余年来,Warburg效应反复地在多种肿瘤细胞中被证实,目前被认为是肿瘤的一个显著特征,然而Warburg效应的背后所隐含的机制和生物学意义仍不明确。由于这些研究将细胞的干性、代谢可塑性、Warburg效应以及肿瘤联系起来,因此,研究肿瘤的Warburg效应理论上是研究肿瘤干细胞的一个有效手段。基于这些背景知识和理论推导,我们集中研究了Warburg效应在前列腺癌发展过程中的地位,并探究了可能的机制。我们知道,线粒体氧化磷酸化和糖酵解是细胞中两大产能途径,其中丙酮酸是联系糖酵解和三羧酸循环的关键节点,干扰这一关键节点可能改变线粒体氧化磷酸化和糖酵解相对比率,在正常的已分化细胞中,由葡糖糖代谢生成的丙酮酸,首先由位于线粒体内膜上的丙酮酸转运载体(mitochondrial pyruvate carrier,MPC)自胞浆转运进入线粒体基质,随后在丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)的作用之下氧化脱羧,生成乙酰辅酶A,最终进入三羧酸循环进行氧化磷酸化;其中丙酮酸脱氢酶复合体的E1α亚单位(PDHA1)的磷酸化和去磷酸化,是PDHc失活和激活的关键调节方式,PDHA1蛋白的正常表达是线粒体中三羧酸循环和氧化磷酸化正常进行的前提条件。鉴于上述,我们首先以PDHA1为切入点,用免疫组化的方法检测前列腺癌组织中PDHA1蛋白的表达,分析其表达与临床病理学特征以及预后的关系,初步了解能量代谢中的关键酶在前列腺癌中的表达情况;随后在前列腺癌细胞系中敲除PDHA1,导致PDHc功能失活,分析PDHA1基因敲除后细胞中能量代谢的变化,同时研究了该细胞模型的细胞生物学与干细胞特征;此外,我们应用MPC特异性抑制剂UK5099处理前列腺癌细胞,分析处理前后细胞的能量代谢特点的变化,并分析处理前后细胞的生物学特性和干细胞特征,分析能量代谢变化与前列腺癌干细胞特性之间的联系,目的在于探讨能量代谢模式转换是否可调控前列腺癌细胞干性程度。第一部分:PDHA1蛋白在前列腺癌组织中的表达以及与预后的分析研究方法1.利用免疫组化的方法,检测88例前列腺癌组织中PDHA1蛋白的表达情况。并分析PDHA1蛋白表达与临床病理学特征、患者生存期之间的关系。2.应用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析检验PDHA1蛋白表达与各临床病理学特征之间的关系;生存曲线采用Kaplan-Meier和log-rank分析检验。研究结果1.在88例前列腺癌中,34(38.64%)例阳性表达PDHA1蛋白,54(61.36%)例为阴性,PDHA1蛋白表达与前列腺癌Gleason分级相关,Gleason分级小于7的27例前列腺癌标本中,15例(55.6%)为阳性,在Gleason分级等于7的41例标本中14例(34.15.9%)为阳性,但在Gleason分级大于7的20例标本中仅有5例(25%)为阳性性(p<0.05),PDHA1蛋白表达与其它临床病理学参数无相关性。2.88例患者中PDHA1蛋白表达阴性者的患者,总生存率显著低于PDHA1蛋白阳性患者(p<0.05)。第二部分:PDHA1基因敲除对前列腺癌细胞代谢模式和干性程度的影响研究方法1.构建TALEN质粒,利用TALEN介导的基因编辑技术在前列腺癌细胞Ln Cap中进行了PDHA1基因的纯合性敲除,挑选单克隆,建立稳定细胞系。2.通过检测细胞内ATP、葡萄糖含量、以及应用Seahorse Extracellular Flux24F能量代谢分析设备分析细胞内葡萄糖代谢偶联的细胞氧耗(OCR)和胞外酸化速率(ECAR)的变化,分析敲除PDHA1基因后细胞代谢中糖酵解速率和线粒体氧化磷酸化程度的变化。3.PDHA1基因敲除后,用细胞计数法了解细胞增殖能力,Transwell assay了解迁移能力,Hoechst 33342染色及流式细胞仪分析侧群细胞(SP)比率,测试对化疗药物的敏感性,放疗后的克隆形成实验了解放疗敏感性,以及流式细胞仪和Western blot分析干细胞标记CD44、ABCG2、Oct3/4、Nanog表达的改变。研究结果1.成功建立了PDHA1基因敲除的稳定细胞系。2.PDHA1基因敲除后,线粒体氧化磷酸化程度被抑制,糖酵解速率提高,表现为基础OCR降低,基础ECAR升高,葡萄糖摄取能力升高,ATP产量降低。3.PDHA1基因敲除后,肿瘤细胞的增殖受到抑制,但是肿瘤细胞的体外移动能力增强,并且这些细胞呈现显著的化疗和放疗抵抗,SP细胞比率增加,干细胞标记CD44、ABCG2、Oct3/4、Nanog表达升高等,提示PDHA1基因敲除后的前列腺癌细胞更加具有肿瘤干细胞样细胞的特性。第三部分:MPC抑制剂UK5099对前列腺癌细胞代谢模式和干性程度的影响研究方法1.用合适浓度的MPC抑制剂处理Ln Cap细胞。2.以丙酮酸试剂盒、ATP试剂盒分析细胞胞浆中丙酮酸的浓度的变化、细胞ATP产量,以及使用线粒体膜电位JC-1探针和通过流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化,初步分析细胞代谢中线粒体氧化磷酸化程度和糖酵解速率的转变。2.用UK5099抑制丙酮酸转运进入线粒体后,观察Ln Cap细胞增殖的情况,流式细胞仪分析细胞周期、Hoechst 33342染色及流式细胞仪分析侧群细胞(SP)比率以及Western blot检测干细胞标记的表达水平的变化。研究结果1.应用MPC抑制剂UK5099处理细胞,证实了UK5099可以抑制丙酮酸转运进入线粒体基质。2.UK5099处理Ln Cap细胞后,ATP产量降低,乳酸产量增高,线粒体膜电势降低,提示线粒体氧化磷酸化程度收到抑制,糖酵解速率提高。3.UK5099处理Ln Cap细胞后,细胞增殖受到抑制,细胞G1/G0比例增加,SP细胞比率增加,干细胞标记Oct3/4和Nanog表达升高。研究结论1.我们检测PDHA1蛋白在前列腺癌组织中的表达情况,发现PDHA1蛋白阴性表达与较差的预后相关,提示糖酵解通路可能在前列腺癌发生发展中发挥了重要的作用。2.敲除PDHA1基因以造成丙酮酸氧化脱羧障碍,或外源性应用UK5099抑制丙酮酸转运进入线粒体,均可以抑制线粒体氧化磷酸化,促进糖酵解速率,可以作为研究Warburg效应和肿瘤干细胞的模型。3.糖酵解程度升高的代谢模式促进了前列腺癌细胞干性程度的提高,这可能是PDHA1阴性表达患者预后差的基础,本研究也间接提示了肿瘤干细胞样细胞的存在可能是Warburg现象产生的原因,我们的研究对于理解前列腺癌的发生发展机制以及探索新的治疗靶点提供新的视角。