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早在1986年,我室通过一系列研究表明,延髓面神经后核内侧区(medial areaof nucleus retrofacialis,mNRF)是产生基本节律性呼吸的部位,在呼吸节律发生中具有至关重要的作用。1991年,Smith证实前包氏复合体(pre-B(o)tzingercomplex,pre-B(o)tC)是呼吸节律发生的部位,mNRF和pre-B(o)tC定位的区域全部位于延髓的腹外侧区,相互之间不完全相同,但都有重叠。因此,对基本节律性呼吸发生的部位已基本确定在延髓头腹外侧区。
对于呼吸节律产生机制的认识上目前主要存在两种学说,即起步细胞学说(pacemaker neuron hypothesis)和神经网络学说(neurons network hypothesis)。目前大多数的研究结果倾向于起步细胞学说。我室在整体及新生鼠离体延髓脑薄片标本的mNRF记录到具有“起步”特征的呼气-吸气跨时相神经元(Expiratory-Inspiratory phase spanning neuron,E-IPS),这类神经元放电开始于吸气前(呼气相的中、晚期),以频率递增的形式发放至吸气开始,然后以恒频的形式持续,最后与吸气性放电同步结束。这类放电总是先于吸气放电的神经元可能就是“起步神经元”(Pacemaker neuron)。
多沙普仑作为一种安全、有效的呼吸兴奋剂,被广泛应用于中枢性呼吸衰竭的治疗。另外在全身麻醉后复苏、治疗新生儿呼吸功能不全等应用,具有疗效确切、副作用小的优点。一般认为,小剂量时(0.05-0.25 mg/kg)主要兴奋颈动脉体化学感受器球形细胞,大剂量时则可直接兴奋延髓神经元,包括呼吸及非呼吸神经元,产生强烈的呼吸兴奋效应。现知,对钾通道的阻滞,从而使钙依赖性的兴奋性神经递质释放增加是其兴奋呼吸的机制。然而对于其兴奋呼吸中枢的机制尚未明了,胶质细胞是否参与其中更是不得而知。
长期以来,人们一直认为胶质细胞只是中枢神经系统中的一个没有活性的组分,其作用主要是起支持功能。然而事实并非如此,随着研究的深入,胶质细胞的众多功能逐渐为人们所认识。首先,从组织结构上看,胶质细胞包裹着中枢神经突触；从功能上看,胶质细胞可以合成和分泌神经递质,表达神经递质受体,组装载体,吸收并运输细胞外和突触间隙的神经递质。
现知,在整体哺乳动物或脑片标本中,给以胶质细胞三羧酸循环过程的阻断剂氟醋酸盐(fluoroacetate)或硫酸蛋氨酸(methionine sulfoximine,MS),可观察到节律性呼吸活动被明显抑制；重新给以三羧酸循环的底物异柠檬酸盐或谷氨酰胺,则节律性呼吸的放电活动可完全恢复。
本研究目的在于:
1)制作包含面神经后核内侧区的延髓脑干标本,应用神经根记录技术,观察兴奋性药物多沙普仑(Doxapram)及抑制性调节药物丙泊酚(Propofol)对脑片RRDA的影响,并研究胶质细胞正常代谢在此调节过程中的作用;
2)通过干扰胶质细胞代谢,观察脑片RRDA的改变,应用细胞外记录技术,研究在此过程中呼吸相关神经元的电生理改变；
3)应用RT-PCR技术,研究胶质细胞相关受体(甘氨酸转运体1,GlyT1)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在mNRF的表达情况。
第一部分、呼吸兴奋剂多沙普仑对新生大鼠延髓脑片标本RRDA的调节作用
随机分成6组,(n=6)。Ⅰ组为对照组(MKS组),Ⅱ～Ⅳ组多沙普仑(Sigma)组(浓度分别为2、5、10μmol/L),V组给予丙泊酚(AstraZeneca,20μmol/L),Ⅵ组给予丙泊酚(20μmol/L)+多沙普仑(5μmol/L),持续灌流3min。观察给药后1、3、5、10、15、30 min时舌下神经根RRDA的变化,并通过生物信号采集系统计算给药后吸气神经元的放电时程(TI)、放电积分幅度(IA)、呼气时程(TE)(吸气神经元非放电期)及呼吸频率(RC)的变化。
Ⅰ组、Ⅱ组在各测量时间点,舌下神经根RRDA各项指标均无明显改变(P>0.05)；Ⅲ组、Ⅳ组在分别加入5μmol/L、10μmol/L多沙普仑后,舌下神经根RRDA的吸气时程(TI)从第1 min开始延长,于10 min时达最大值,较给药前分别增加47.4％和39.2％(P<0.05)；呼气时程(TE)由第5 min时开始缩短,至第10min时达最小值,分别较给药前减少24.9％和17.3％(P<0.05)；放电积分幅度(IA)从第3min时开始增加,至第10 min时达最大值,分别增加8.6％、12.0％(P<0.05)；V组在加入丙泊酚后,TI从第3 min时开始减小,至第10 min时达最小值(P<0.05),于第3 min时呼气时程开始延长,第10 min时达最大值(P<0.05); 于第3min时IA明显高于给药前,但在第5 min时降至给药前水平,其余时间与给药前均无明显差异(P>0.05)。
第二部分、mNRF胶质细胞在多沙普仑兴奋新生大鼠离体延髓脑片标
本RRDA中的作用
1.阻断胶质细胞代谢对多沙普仑兴奋脑片RRDA的影响
新生SD大鼠24只,分为4组(n=6):组1,对照组,以MKS灌流；组2,以doxapram(5μM)加入MKS灌流10min后,记录舌下神经根RRDA; 组3,Doxapram(5μM)+methionine sulfoximine(MS,10μM)加入MKS灌流10min后,记录舌下神经根RRDA；组4,在组3脑片稳定记录RRDA 10 min后,向MKS加入Glutamine(20 μM),灌流10min后,记录RRDA。
在加入doxapram(5μM)10 min后,Ti,IA分别增加85.0±25.0％、13.2±2.5％(P<0.05),Te、RC分别减少19.0±1.4％、12.8±1.4％(p<0.05)。随后向MKS加入methionine sulfoximine(MS,10μM),多沙普仑的以上兴奋性效应被完全逆转:与组2比,Ti,IA减少,Te,RC增加(p<0.05)。
完成上述实验后,继续向MKS中加入glutamine(20μM),灌流10 min后,多沙普仑的兴奋性效应又重新显现:与组3比,Ti,IA增加,Te,RC减少(p<0.05)；组2与组4间差异无显著性意义(P>0.05)。
2.阻断胶质细胞代谢对mNRF吸气神经元(inspiratory neurons,I-neurons)电活动的影响
此组新生大鼠6只,记录吸气神经元的放电活动。为了记录呼吸神经元,以微操纵器固定玻璃微电极,并通过控制微推进器作mNKF细胞外记录。记录时,每次推进10 μm,直到记录到脑片舌下神经根RRDA和与之具有位相关系的吸气神经元放电。先以50μM MS灌流20 min；洗脱MS,待放电基本恢复后,再以30μM glutamine灌流20 min,分别观察对吸气神经元放电活动的影响。
与MKS灌流组比较,给予50μM MS灌流10 min后,吸气神经元放电的RC延长48.13％(P<0.01),TE延长53.69％(P<0.01),TI缩短25.88％(P<0.01),IA减少27.14％(P<0.05),PFn减少41.89％(P<0.01)；洗脱后改灌30μM glutamine,与对照组比,10 min时,RC缩短37.70％(P<0.01),TE三缩短65.76％(P<0.01),而TI,IA和PFn(The peak discharge frequency,放电峰频率)均无明显变化(TI,P=0.082；P=0.06；PFn,P=0.058)。
第三部分、胶质细胞相关受体(甘氨酸转运体1,GlyT1)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在mNRF的表达
采用荧光定量RT-PCR测定GlyT1、GDNF在延萌面神经后核内侧区“岛”是否表达及表达的量。
1.Gly T1在mNRF的表达:
新生SPF级大鼠10只,随机分成两组(n=5),制作mNRF“岛”取GlyT1表达丰富的三叉神经核周围脑组织作为对照,上游引物:5’-AGATGATGCTGGGGTTCCCAC-3’、下 游 引 物:5’-CGCCGAAGACCACTCCCTC-3’；扩增片段长229 bp；内参选用大鼠β-actin,上游引物5’-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3’,下游引物5’-CTC TCA GCTGTG GTG GTG AA-3’,扩增片段长度228bp。
2.GDNF在mNRF的表达:
分组、对照同Gly T1,上游引物:5’-ACGACAAAGCCATGAGGAAGCC-3’、下游引物:5’-TTCGAGGAAGTGCCGCCGC-3’,其余同Gly T1组。
结论:1)呼吸兴奋剂多沙普仑(>5μmol/L)可直接兴奋脑片呼吸中枢,且可拮抗丙泊酚对脑片RRDA的抑制效应,其作用主要通过兴奋吸气中枢实现；2)胶质细胞正常代谢在脑片RRDA的调节中至关重要,参与了多沙普仑对脑片的兴奋效应；3)阻断胶质细胞代谢可能介导了吸气神经元的抑制性突触输入,从而对脑片呼吸放电呈抑制效应；4)GlyT1、GDNF在mNRF存在高表达,可能是胶质细胞参与中枢性呼吸发生及调控的重要神经递质。