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目的:1.观察缝隙连接蛋白32(Connexin32,Cx32)对肝癌阿霉素敏感株HepG2细胞和肝癌阿霉素耐药株HepG2/(Doxorubincin,Dox)细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。2.探讨PI3K/Akt信号通路在Cx32调控肝癌EMT中的作用。方法:1.免疫组化法检测收集的40例肝癌组织以及相应的癌旁组织中Cx32、E-cadherin、Vimentin的表达水平,并分析Cx32的表达与E-cadherin、Vimentin表达的相关性。2.MTT法测定不同浓度的阿霉素对HepG2和HepG2/DOX细胞增殖的影响。3.Transwell法检测HepG2和HepG2/DOX细胞的侵袭、迁移能力。4.Western blot法检测HepG2和HepG2/DOX细胞中Cx32、E-cadherin、Vimentin、p-Akt、Akt的表达水平。5.构建pcDNA-Cx32和Cx32-shRNA真核表达质粒载体,应用Lipofectamine2000将其分别转染至HepG2/DOX和HepG2细胞中;采用Western blot法检测HepG2和HepG2/DOX细胞中Cx32、E-cadherin、Vimentin、p-Akt、Akt的表达水平,Transwell法检测HepG2和HepG2/DOX细胞的侵袭、迁移能力。6.在HepG2/DOX细胞中,用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后,采用Western blot法检测细胞EMT指标蛋白:E-cadherin、Vimentin以及p-Akt、Akt等蛋白的表达水平,Transwell法检测细胞的侵袭、迁移能力。7.在HepG2细胞中,用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,并将Cx32-shRNA质粒载体转染至HepG2细胞中,Western blot法检测细胞EMT指标蛋白:E-cadherin、Vimentin的表达水平,Transwell法检测细胞的侵袭、迁移能力。结果:1.EMT标志蛋白与Cx32表达的相关性免疫组化结果显示:Cx32、E-cadherin在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织;Vimentin在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,使用Spearman相关分析法得出Cx32的表达和E-cadherin的表达呈正相关,Cx32的表达与Vimentin的表达呈负相关。2.HepG2/DOX细胞对阿霉素产生耐药性MTT结果显示:HepG2细胞的IC50值为0.182μg/mL,HepG2/DOX细胞的IC50值为2.113μg/m L,HepG2/DOX细胞耐药指数为11.61,结果说明HepG2/DOX细胞对阿霉素产生了获得性耐药。3.HepG2/DOX细胞Cx32的表达显著降低Western blot结果显示:与HepG2细胞相比,HepG2/DOX细胞Cx32的表达显著降低。4.HepG2/DOX细胞发生了明显的EMT Western blot结果显示:与HepG2细胞相比,HepG2/DOX细胞E-cadherin表达明显降低,Vimentin表达显著上升;Transwell结果显示:相比于HepG2细胞,HepG2/DOX细胞的侵袭、迁移能力明显提高,结果说明HepG2/DOX细胞发生了EMT。5.Cx32能够调控肝癌细胞的EMT在HepG2细胞中沉默Cx32的表达后,Western blot结果显示:E-cadherin表达明显降低,Vimentin表达显著上升,Transwell结果显示:细胞的侵袭、迁移能力显著增强;HepG2/DOX细胞过表达Cx32后,Western blot结果显示:E-cadherin表达明显上升,Vimentin表达显著降低,Transwell结果显示:细胞的侵袭、迁移能力降低;结果说明Cx32能够调控肝癌细胞的EMT。6.Cx32可调控肝癌细胞中PI3K/Akt信号通路的活性Western blot结果显示:HepG2细胞中沉默Cx32的表达后,p-Akt的表达水平显著升高,提示PI3K/Akt信号通路被激活;而在HepG2/DOX细胞中过表达Cx32后,p-Akt的表达水平降低,提示PI3K/Akt信号通路被抑制。说明在人肝癌细胞中,Cx32可调控PI3K/Akt信号通路的活性。7.在HepG2/DOX细胞中,阻断PI3K/Akt信号通路能够逆转EMT Western blot结果显示:与HepG2细胞相比,HepG2/DOX细胞中p-Akt的表达明显增加;使用LY294002处理HepG2/DOX细胞阻断PI3K/Akt信号通路后,抑制p-Akt的表达并且能上调E-cadherin的表达,降低Vimentin的表达,且Transwell结果显示:HepG2/DOX细胞的侵袭、迁移能力显著降低;结果说明,HepG2/DOX细胞发生EMT后PI3K/Akt信号通路处于激活状态,阻断PI3K/Akt信号通路后可以逆转HepG2/DOX细胞的EMT。8.LY294002可阻断shRNA-Cx32对HepG2细胞EMT的调控作用HepG2细胞中沉默Cx32的表达后,Western blot结果显示:p-Akt和Vimentin的表达水平显著升高,E-cadherin的表达水平显著降低;Transwell结果显示:细胞的侵袭迁移能力显著增强;然而用LY294002处理HepG2细胞阻断PI3K/Akt信号通路后,进一步采用shRNA-Cx32沉默HepG2细胞中Cx32的表达,Western blot法检测结果显示:shRNA-Cx32+LY294002组细胞的E-cadherin、Vimentin表达水平与沉默阴性对照组(negative control group)相比,均没有显著差异,Transwell法检测结果显示:shRNA-Cx32+LY294002组细胞的侵袭、迁移能力与干扰阴性对照组(negative control group)相比,也无显著差异。结果说明,LY294002可阻断shRNA-Cx32对细胞EMT的调控作用,提示PI3K/Akt信号通路介导了Cx32对肝癌细胞EMT的调控。结论:1.调控PI3K/Akt信号通路能够影响肝癌细胞EMT的发生。2.Cx32通过PI3K/Akt信号通路影响肝癌细胞的EMT。