论文部分内容阅读
苦荞(Fagopyrum tatarium)是一种药食两用植物，不仅具有丰富的营养，而且富含以芦丁为代表的黄酮醇类化合物。黄酮醇合成是植物苯丙烷代谢途径的支路之一，在黄酮醇合酶(Flavonols synthetase，FLS)的催化下，二氢槲皮素(Dihyquercetin，DHQ)、二氢山奈酚(Dihykaempferol，DHK)和二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DHM)等3种二氢黄酮醇可转化为槲皮素、山奈酚和杨梅素等3种黄酮醇，其中槲皮素经糖基化后转变为芦丁。已有研究表明，苦荞FtFLS基因在染色体上存在多拷贝，预示具有不同的FtFLS同源蛋白参与了苦荞芦丁的合成。本研究基于苦荞花期转录组数据，克隆了苦荞黄酮醇合酶同源蛋白的两条基因FtFLS2和FtFLS3，并进行生物信息学分析;实现其在大肠杆菌中的表达，比较了FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3等3个重组苦荞黄酮醇合酶对3种底物的动力学参数，分析了它们在苦荞芦丁合成中的最适底物。本研究取得了以下主要结果: 1.采用同源克隆和RACE技术，获得2条苦荞黄酮醇合酶同源基因的ORF序列，命名为FtFLS2和FtFLS3。序列分析表明，FtFLS2的ORF为996 bp，编码331个氨基酸残基的蛋白，推导的FtFLS2蛋白相对分子量为37.8 KDa，分子式为C1771H2651N451O502S10， pI为5.52; FtFLS3的ORF为1008 bp，编码335个氨基酸残基的蛋白，推导的FtFLS3蛋白相对分子量为38.1 KDa，分子式为C1723H2689N449O509S10， pI为5.74。Blast分析表明，FtFLS2和FtFLS3与已知的FtFLS1(GenBank ID: JX401285.1)的相似性分别为97％和77％。多重序列比对显示，FtFLS2和FtFLS3含有2-ODD家族蛋白的保守功能区Conserved domainA、Conserveddomain B、Fe2+离子结合位点和2-酮戊二酸结合位点，属于典型的2-酮戊二酸依赖型的双加氧酶。同源进化树分析表明，FtFLS2与葡萄(Vitis vinifera)的VvFLS(GenBankID: AB213566)聚为簇Ⅲ，FtFLS3与FtFLS1和甜荞(Fagopyrum esculentum)FeFLS聚为簇Ⅰ，推测它们可能具有不同的催化特征。 2.构建FtFLS2和FtFLS3的原核表达载体pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3，并在大肠杆菌中实现的可溶性表达。SDS-PAGE分析表明，重组FtFLS2和FtFLS3蛋白分子量分别为37.8 KDa和38.1 KDa。pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3，及本课题组已获得的基因工程菌pET30-FtFLS1，均置于1 mmol/L IPTG，25℃条件下，诱导10h。菌体经超声波破碎，镍亲和层析，获得电泳纯FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3重组蛋白。薄层层析(TLC)分析表明，3个FtFLS均具有将DHQ转化为槲皮素的活性。在100μmol/L DHQ的反应液中，12.5μg的三种FtFLS蛋白均在15min内催化生成的槲皮素量与反应时间呈直线相关。采用双倒数作图法，测定3个重组FtFLS对DHQ、DHK和DHM的酶促反应动力学参数，结果显示:对3种二氢黄酮醇的米氏常数，FtFLS1分别为KmDHQ=594.17μmol/L(VmaxDHQ=42.55μmol/L·min),KmDHK=1257.18μmol/L(VmaxDHQ=25.53μmol/L·min)和KmDHM=1516.36μmol/L(VmaxDHM=17.76μmol/L·min); FtFLS2分别为KmDHQ=8411.27μmol/L(VmaxDHQ=10.25μmol/L·min),KmDHK=23646.74μmol/L(VmaxDHQ=13.59μmol/L·min)和KmDHM=21583.23μmol/L(VmxDHM=12.15μmol/ L·min); FtFLS3分别为KmDHQ=6478.21μmol/L(VmaxDHQ=13.97μmol/L·min),KmDHK=717.93μmol/L(VmaxDHQ=24.04μmol/L·min)和KmDHM=1609.36μmol/L(VmaxDHM=17.83μmol/L·min)。分析表明， FtFLS1和FtFLS2的最适底物均为DHQ， FtFLS3的最适底物为DHK。以上研究结果，加深了对苦荞黄酮醇合成支路代谢流向和流量的认识。