三七土传根腐病拮抗菌筛选及其生防效果研究

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三七(Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen),五加科人参属多年生珍贵中草药植物,目前主要种植于云南和广西的部分地区。三七根腐病是一种复杂的土传病害,病原包括真菌、细菌以及线虫等微生物,尖孢镰刀菌是较为典型的根腐病病原真菌。生防法防控多通过分离对作物病原菌具有拮抗性质的真菌与细菌,从而对作物根际病原微生物起到抑制作用,防控土传病害的发生。因此,本研究从发病三七根际土壤中分离出两株对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum,FO)有拮抗能力的菌株KW6与KW8,探究了两株拮抗菌最佳培养条件,并通过盆栽试验,了解了添加不同浓度的拮抗菌防控尖孢镰刀菌根腐病的效果,以及对三七植株鲜重和三七根际微生物区系的影响。此外,进一步探究了病原菌FO及其分泌的毒素对两株拮抗菌生长以及功能酶活的影响。结果如下:1、首先从发病三七根际土壤中分离出对病原菌FO生长有较强抑制作用的两株拮抗菌。经鉴定,确定菌株KW6为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis KW6),菌株KW8为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes KW8)。贝莱斯芽孢杆菌KW6在装液量为50m L/250m L时生长量最好,较耐酸、不耐碱,最适宜碳源为果糖,最适宜氮源为牛肉膏。产酶溶杆菌KW8在装液量为75m L/250m L时生长量最高,在p H为5-8时生长正常,最适宜碳源为蔗糖,最适宜氮源为酵母粉。2、接种两株拮抗菌至三七根内部,发现贝莱斯芽孢杆菌KW6与产酶溶杆菌KW8对三七根不具有致病性;通过盆栽试验发现无论拮抗菌施用浓度为10~6还是10~8,均可以有效降低三七根腐病发病率,并且可以增加三七植株尤其是根部的鲜重,拮抗菌促进生长发育的能力随着拮抗菌浓度增加而提升。施用10~8的拮抗菌KW6可减少三七根际土中真菌OTU数量,降低真菌物种数量与物种丰富度,但不会明显改变真菌群落结构。施用一定浓度的拮抗菌KW6与KW8也可降低三七根际土壤中细菌OTU数量,且贝莱斯芽孢杆菌KW6可降低细菌物种数量、丰富度以及多样性。相比对照组,施用不同浓度的拮抗菌KW6与KW8均可以显著降低潜在病原真菌Alternaria的相对丰富度。与对照组相比之下,施用不同浓度拮抗菌不会明显改变三七根际土壤中真菌菌群功能单元,但不同浓度水平处理组间有明显差异,此外,施用10~8的贝莱斯芽孢杆菌KW6与产酶溶杆菌KW8均可以显著改变细菌菌群功能单元。代谢通路统计结果表明,三七根际土壤中真菌菌群代谢主要集中在生物合成功能与前体代谢产物与能量的产生功能,而细菌菌群代谢通路主要集中在生物合成功能。三七植株中FO定殖结果表明,拮抗菌可以显著降低茎部与根部中病原菌FO数量,产酶溶杆菌对病原菌数量有更明显的控制效果,FO定殖数量随着拮抗菌浓度增加而降低。3、本研究对拮抗菌B.velezensis KW6与L.enzymogenes KW8基因组进行测序,结果表明贝莱斯芽孢杆菌KW6总序列数与序列长度均低于产酶溶杆菌KW8,在两个拮抗菌功能酶中糖基转移酶(GTs)、碳水化合物脂酶(CEs)与糖苷水解酶(GHs)基因数量较多。贝莱斯芽孢杆菌KW6与产酶溶杆菌KW8均可产生不同生物量的纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶,在等量酶活水平下可以显著降低FO种群密度,此外,FO与拮抗菌共培养,只增加贝莱斯芽孢杆菌KW6产纤维素酶能力,而对产酶溶杆菌KW8产酶能力无明显影响,而灭活FO可以诱导提高拮抗菌KW6与KW8产纤维素酶、葡聚糖酶与几丁质酶能力。相比对照组,当病原菌毒素为5μg/m L时会显著抑制贝莱斯芽孢杆菌KW6的生长、产酶能力,当病原菌毒素FA为1μg/m L会显著抑制产酶溶杆菌KW8的生长、产酶能力,在用量为1μg/m L对KW6与KW8的生物膜形成能力均产生显著抑制作用。
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