寡孢节丛孢的REMI法随机突变及突变株相关特性分析

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捕食线虫真菌能产生特殊的捕食器官捕捉线虫,是重要的线虫生防资源。寡孢节丛孢是捕食线虫真菌类群中的代表菌株,也是该类群中分子背景研究得最为清楚的真菌之一。其全基因组序列及注释信息已经被发表;同时,通过对捕器菌丝和营养菌丝的表达蛋白差异分析,参与三维菌网形成的关键生物学途径已经被报道。作为寡孢节丛孢标志性生理结构的三维菌网,不仅是其捕杀线虫的武器和发挥生物防治功能的基础,也是该类群真菌从腐生生活向寄生生活阶段转变的重要标志。但是,三维菌网形成的分子机制还不清楚。捕食线虫真菌侵染线虫的过程极其复杂,目前对于每个关键环节的分子调控机理还不清楚。本论文以获取随机插入型突变株为基础,进行了多方面的表型特征比较,筛选得到一批表型和功能特异的突变株。同时,分离和鉴定了一个新的锌指蛋白基因,并对其功能进行了初步分析和研究。  主要实验结果:  1.运用限制性内切酶介导的转化方法对寡孢节丛孢的原生质体进行了转化,共获得37株抗性标记稳定遗传的随机插入性突变株,遗传稳定性约为87.5%;随机选取了九个突变株与野生株进行了生长速率、产孢率、孢子萌发形态、抗逆性(氧化、高渗和细胞壁合成干扰)、捕器产生和侵染能力、胞外蛋白酶水解能力等方面的表型特征比较,发现突变株的表型均有不同程度的变化。  2.运用染色体步移技术,对产孢能力及抗逆能力增强的突变株X5,以及不产生捕器的突变株X13进行了突变位点的分离。其中,突变株X5基因组上的插入位置在基因AOL_s00076g273和AOL_s00076g274之间,分别离两基因起始密码子915 bp和8086 bp;突变株X13基因组上的插入位置在基因AOL)_s00078g287和AOL_s00078g288之间,分别距离两基因起始密码子739 bp和451 bp。  3.运用RT-qPCR技术分别比较了野生型菌株(WT)和X5/X13突变株中四个基因在不同条件下的相对转录量。  (i)正常培养条件下(2天、4天和6天),相对于WT,突变株X13中AOL_s00078g287的转录水平下降了60%~75%,同时AOL_s00078g288的转录水平下降了67%~90%; X5中AOL_s00076g273只有5%左右的转录水平差异,而AOL_s00076g274的转录水平却明显上调,是WT的1.7~1.98倍。故可推测X13的表型变化是由于两个基因的表达减少所共同影响的,而X5的表型变化则由AOL_s00076g274的过量表达所造成;  (ii) WT被线虫诱导24 h后,AOL_s00076g273、AOL_s00076g274、AOL_s00078g287和AOL_s00078g288的相对转录量分别是诱导前的0.96倍、5.48倍、5.79倍和2.64倍。结果表明后三个基因可能参与了捕器形成的过程。  4.对蛋白AOL_s00076g274p的氨基酸序列进行了系统发育分析、保守功能域分析和结构预测等,包括Blastp、InterProScan、Predict Protein、Swiss-Model和STRING等分析。结果表明:其具有典型的C2H2型和Cys6Zn(Ⅱ)2型锌指蛋白功能结构域,是真菌中一个潜在的转录因子,且系统发育分析显示它与其它真菌来源的锌指蛋白相似性较低。将其与GFP融合后在酵母中异源表达并观察,确定了其亚细胞水平上的功能定位是在细胞核中。  本文创新点:  1.获得了一批寡孢节丛孢的随机插入型突变子,为后续筛选表型和功能特异的突变株提供了资源。  2.在寡孢节丛孢中发现了一个新的锌指蛋白,其可能参与了产孢、生长发育和捕器形成等相关功能基因的转录调控。
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