【摘 要】
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烟草环斑病毒(Tobacco Ringspot Virus-TRSV)是中国二类对外检疫危险性病毒,根据TRSV RNA序列设计合成引物,提取病毒RNA,反转录成CDNA后进行PCR扩增.PCR的反应条件试验证明,
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烟草环斑病毒(Tobacco Ringspot Virus-TRSV)是中国二类对外检疫危险性病毒,根据TRSV RNA序列设计合成引物,提取病毒RNA,反转录成CDNA后进行PCR扩增.PCR的反应条件试验证明,在20ul反应体系中,0.2ul引物(10pmol/ul),0.8ul2.5mM4×dNTP,0.2ulTaqDNA聚合酶(1个单位),15mM Mg<2+>为最佳组合,可扩增出特异性带,并且无非特异性带产生,扩增香石竹斑、南芥菜花叶病毒和健康大豆、烟草的核酸没有特异性带出现.从而建立了PCR检测TRSV的试验技术,该技术检测纯化TRSV RNA灵敏度达400pg,从受侵染的烟草叶片300ng总核酸中可扩增出TRSV的特异性带,为口岸提供了一种新的先进检测手段.同时,将TRSV的PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接,克隆到大肠杆菌TGI中,得到白色菌落100余个,重组质粒6个,通过酶切鉴定、PCR扩增和序列分析,表明TRSV的PCR产物确实插入了质粒,并已克隆到大肠杆菌中.测序240个碱基,与资料显示的引物间序列相比较,同源性达92.5%,解决了病毒检疫应用中阳性对照有扩散危险的疑难问题.
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