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研究背景：脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养素家族中一个重要的成员。它对中枢神经系统神经元的发育，生长，存活，分化，尤其在突触可塑性方面发挥着重要作用。长时程增强(long-term potentiation，LTP)是突触可塑性的一种形式，已被公认为是学习记忆在细胞水平的生物学基础。BDNF的受体有两种，p75神经营养素受体和TrkB酪氨酸激酶受体。BDNF的信号转导和神经营养作用主要通过TrkB受体来实现，到目前为止，据报道BDNF的突触功能均通过TrkB受体来调节。研究显示，BDNF优先作用于活化的神经元。在视网膜神经节细胞和脊髓运动神经元中，应用去极化药物刺激可增加其细胞膜表面TrkB受体的表达；高频强直刺激可快速促进TrkB向海马神经元膜表面的插入，且这一过程要求钙离子通过NMDA受体和钙通道的内流，以及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活，上述所用实验方法均为膜表面生物素化。
研究目的：到目前为止，TrkB活性依赖性膜表面插入的分子机制还不是很清楚，以前的研究中大多应用膜表面生物素化的方法和BDNF受体结合的方法研究TrkB的活性依赖性膜表面插入。但这些方法都存在一定的缺点，如不能进行形态学观察以及不能进行细胞胞体和突起尤其突触等不同区域TkrB分布水平的定量研究。本文欲建立一种新的研究方法，为进一步研究TrkB的活性依赖性膜表面插入机制提供新的方法。
实验方法：⑴TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法的建立，验证和应用。⑵膜表面生物素化的方法。⑶western blot。
实验结果：
⑴TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法。我们首先构建了一个带有FLAG标签及与GFP融合的TrkB的真核表达质粒(FLAG-TrkB-GFP)，把此质粒转染到体外培养的海马神经元中，在非透化(细胞膜完整性不破坏)的条件下，我们用抗FLAG的一抗及红色荧光标记的二抗对细胞膜表面的TrkB进行染色，GFP代表细胞总的TrkB水平。细胞膜表面TrkB水平用FLAG染色的的荧光强度与GFP荧光强度的比值来定量测量。我们称这种方法为“TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法”。为了验证膜表面TrkB荧光定量方法的有效性，应用高钾或者Forskolin刺激1h能显著增加海马神经元膜表面的TrkB水平。此结果与前人研究结论相一致。进而本实验用甘氨酸(一种诱导化学性LTP-cLTP的诱导剂)刺激激活NMDA受体观察其能否增加海马神经元膜表面的TrkB量。通过定量分析荧光强度比值，我们得出KCL引起的去极化或cAMP的增加能够引起膜表面TrkB水平的增加，分别为1.5±0.18倍和1.45±0.14倍；但cLTP引起膜表面TrkB增加的能力更为显著，甘氨酸刺激下膜表面TrkB增加了1.82±0.08倍。因此我们选择甘氨酸作为进一步研究活性依赖性TrkB膜表面插入机制的刺激药物。
⑵cLTP促进TrkB受体快速向细胞膜表面的插入。以前的研究证明神经元的活性能够快速增加TrkB膜表面水平，但这种作用的时间曲线还不是很清楚。我们应用甘氨酸在不同时间对神经元进行刺激，然后定量分析细胞膜表面TrkB水平。绘制以时间为横坐标，神经元突起部位膜表面TrkB/总的TrkB的荧光强度比值为纵坐标的曲线图。在甘氨酸作用10分钟时，细胞膜表面TrkB水平进入平台期，t1/2为2.3分钟。此结果进一步证明了cLTP刺激可促进TrkB向膜表面的快速定位，且选择10分钟作为以后实验的时间点。
⑶TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法的验证。为了确定外源过表达的FLAG-TrkB-GFP是否能够反映内源性TrkB受体的活性依赖性插入机制，我们用膜表面生物素化的方法来测量海马神经元内源性TrkB在cLTP作用下膜表面含量是否增加。定量分析TrkB免疫印迹显示，内源性全长TrkB(TrkBFL)在甘氨酸作用下膜表面增加了1.75倍，而截短的TrkB(T1，一种天然存在的TrkB截短异构体)膜表面水平却没有变化。由此我们得出结论cLTP引起神经元膜表面FLAG-TrkB-GFP增加的程度与内源性TrkB膜表面增加程度一致。为了证明TrkB受体C末端融合的GFP标签是否影响其胞内运输，我们利用无GFP的TrkB质粒结合免疫细胞染色的方法进行验证。结果与TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法结果一致，由此证明GFP标签不影响TrkB的活性依赖性膜表面插入。
⑷cLTP诱导的细胞膜表面TrkB水平的增加主要是在神经元突起部位。本文中应用我们建立的TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法测得cLTP诱导的细胞膜表面TrkB水平的增加主要是在神经元突起部位。在以下研究中我们主要对突起部位进行定量分析。
⑸TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析方法的应用。应用放线菌酮(抑制蛋白合成的抑制剂)对甘氨酸刺激的TrkB膜表面增加没有影响，这一结果与以前的研究相一致。海马神经元在应用甘氨酸刺激之前先分别应用80μM MK-801(NMDA受体的抑制剂)，20μM BAPTA/AM(细胞内钙离子的螯合剂)和2mM EGTA(细胞外钙离子的螯合剂)分别作用，与对照组相比，三种抑制剂均阻断了甘氨酸诱导的膜表面TrkB增加。由此我们得出结论，NMDA受体的激活和通过钙通道钙离子的内流是cLTP促进TrkB膜表面插入所必需的。微管解聚剂Nocodazole及微丝解聚剂cytochalasin D的预处理完全阻止了活性依赖性TrkB膜表面插入，这预示着甘氨酸诱导的TrkB膜表面插入是微丝微管依赖性的。
实验结论：①建立了一种研究TrkB活性依赖性膜表面插入的新方法，并证明了其有效性。②选择甘氨酸作为进一步研究活性依赖性TrkB膜表面插入机制的刺激药物。③绘制了cLTP促进TrkB受体向细胞膜表面插入的时间曲线，在甘氨酸作用10min时，TrkB膜表面水平达到平台期。由此证明cLTP刺激促进TrkB受体快速向细胞膜表面的插入。我们选择甘氨酸刺激10分钟作为以后实验的时间点。④TrkB活性依赖性膜表面插入不依赖于新蛋白的合成，依赖于NMDA受体的激活和通过钙通道的钙离子内流，同时依赖于微丝微管的完整性。