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第一部分FOXO3a在血清素促进肝细胞肝癌细胞增殖中的作用及机制研究实验目的：外周血清素(5-羟色胺)在肝细胞肝癌的发生及促增殖过程中起到重要作用,然而血清素是如何发挥其促进增殖作用的机制尚未清楚。FOXO3a是一个参与多种细胞关键信号通路的重要转录因子,在本研究中,我们将探寻FOXO3a是否在血清素介导的肝细胞肝癌细胞增殖的通路中发挥作用及其机制。材料与方法：选取3种肝细胞肝癌细胞系(HuH-7、HepG2和Hep3B),利用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)、细胞增殖检测试剂盒(Edu)及流式细胞周期检测分别检测血清素在有血清及无血清培养条件下对3种细胞系的细胞活力及增殖情况的影响,并且同时测量不同条件下细胞内FOXO3a的mRNA、蛋白的磷酸化表达、细胞定位及FOXO3a上游调控因子AKT的磷酸化表达。利用RNAi干扰技术和细胞质粒转染技术分别抑制和上调3种肝细胞肝癌细胞系中FOXO3a的表达,观察此时血清素在不同培养条件下细胞活力、增殖及细胞内FOXO3a的mRNA及蛋白表达变化。检测不同培养条件下血清素2B受体的表达,并且利用其特异性抑制剂观察对血清素促增殖作用的影响及肝细胞肝癌细胞内FOXO3a的表达变化。结果：3种细胞系在无血清的培养条件下其细胞增殖受到严重抑制,血清素在无血清的培养条件下可以逆转HuH-7细胞的增殖抑制,但在加入血清的培养体系中不能起到促使HuH-7细胞增殖的效果；血清素不能逆转血清剥离环境中HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制。血清剥离显著下调了3种细胞FOXO3a的表达,加入血清素可以显著上调HuH-7细胞FOXO3a的表达但对HepG2和Hep3B细胞FOXO3a的表达则无影响。血清素上调了血清剥离环境中HuH-7细胞的FOXO3a及其上游激酶AKT的磷酸化水平,但对FOXO3a的核定位却无影响；血清素不能改变血清剥离环境中HepG2和Hep3B细胞的FOXO3a的磷酸化表达。非磷酸化FOXO3a的质粒可以显著上调FOXO3a的表达并且促使血清剥离环境中3种细胞的增殖；而干扰FOXO3a的表达促进了血清剥离环境对3种细胞的增殖抑制作用。相较于HepG2和Hep3B细胞,血清素2B受体在HuH-7细胞中高表达,其特异性抑制剂干扰了血清素诱导的HuH-7细胞FOXO3a的上调并逆转了其促增殖作用。结论：本研究结果表明,在血清剥离环境中FOXO3a是肝细胞肝癌细胞的促增殖因子,血清素通过上调肝细胞肝癌细胞的FOXO3a起到促进细胞增殖的作用并且血清素的增殖作用是血清素2B受体介导的。以肝细胞肝癌细胞中血清素-血清素2B受体-FOXO3a通路为靶点的开发药物可以为肝细胞肝癌的治疗提供新的思路。第二部分FOXO3a在多柔比星诱导肝细胞肝癌细胞发生上皮间质转化中的作用及机制研究实验目的：肝细胞肝癌治疗中经常发生的肝细胞肝癌化疗耐药是导致肝细胞肝癌死亡率一直居高不下的重要原因。多柔比星是肝细胞肝癌化疗中最为常用的药物之一,而肝细胞肝癌细胞常发生的上皮间质细胞转化是造成肝细胞肝癌对多柔比星耐药的主要原因。盐霉素是一种离子载体类抗生素,其可以选择性杀伤肿瘤干细胞。在本研究中,我们将探索盐霉素是否与多柔比星可以发挥协同杀伤肝细胞肝癌细胞的作用及其中的内在机制。材料与方法：选取4种肝细胞肝癌细胞系(HuH-7、HepG2、SNU-449和SNU-387),利用细胞活力检测试剂盒与蛋白免疫印迹技术检测肝细胞肝癌细胞在多柔比星单用或多柔比星联和盐霉素处理后的细胞活力和上皮间质细胞转化的相关蛋白指标。利用蛋白免疫印迹技术及细胞免疫荧光检测肝细胞肝癌细胞在多柔比星单用或多柔比星联和盐霉素处理后FOXO3a的表达水平、磷酸化水平及亚细胞定位。利用质粒转染或者FOXO3a siRNA技术上调或者抑制FOXO3a的表达,观察肝细胞肝癌细胞对多柔比星单用或多柔比星联和盐霉素处理的细胞活性及上皮间质转化相关蛋白指标的表达变化。利用细胞免疫共沉淀技术观察FOX03a与对促进肝细胞肝癌细胞发生上皮间质转化的重要因子β-catenin的相互结合情况及β-catenin/TCF靶基因(ZEB1、c-Myc和CyclinD1)的表达情况。最后,我们建立了裸鼠肝细胞肝癌异种移植瘤模型,在体内检测了盐霉素是否与多柔比星发挥协同杀伤肝细胞肝癌细胞的作用。结果：多柔比星显著上调了肝细胞肝癌细胞间质表型标志蛋白vimentin的表达,下调了上皮表型标志蛋白E-cadherin的表达；盐霉素可以逆转多柔比星作用后肝细胞肝癌细胞所发生的上皮间质转化相关蛋白的表达变化并且显著增强了多柔比星的细胞毒性。此外,多柔比星导致肝细胞肝癌细胞FOXO3a磷酸化水平的上调,导致FOXO3a的细胞质定植；盐霉素可以逆转多柔比星诱导的FOXO3a磷酸化并且使FOXO3a在细胞核内积聚。抑制FOXO3a的表达使盐霉素不能逆转多柔比星引起的肝细胞肝癌细胞上皮间质转化并且破坏了盐霉素对多柔比星的促杀伤作用,而过表达活化的FOXO3a抑制了多柔比星诱导的肝细胞肝癌细胞上皮间质转化并且显著的增强了其对多柔比星的感敏性。β-catenin/TCF的相互作用及其调控的下游因子的表达是多柔比星诱导肝细胞肝癌细胞发生上皮间质转化的关键因子,β-catenin/TCF结合特异性抑制剂PKF118-310抑制了多柔比星诱导的肝细胞肝癌细胞上皮间质转化并且显著的增强了其对多柔比星的感敏性。过表达活化的FOX03a或盐霉素处理促使FOXO3a/β-catenin的相互结合,使β-catenin/TCF失偶联,并且抑制了TCF4依赖性下游靶基因的转录,干扰了上皮间质转化。结论：本研究表明多柔比星诱导的FOXO3a出核失活对多柔比星诱导的肝细胞肝癌细胞发生上皮间质转化十分必要,盐霉素可以通过抑制多柔比星诱导的FOXO3a出核使FOXO3a在核内聚集,并且竞争性地结合β-catenin,抑制TCF4依赖性下游关键靶基因的转录,从而抑制肝细胞肝癌发生上皮间质转化,增强其对多柔比星的感敏性。