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目的：平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kianse，MLCK．)作为调节平滑肌收缩的关键酶，可以通过与钙离子(Ca<2+>)/钙调蛋白(Calmodulin，CaM)的结合，使肌球蛋白20kD轻链磷酸化，进而激活肌球蛋白的ATP酶活性引起平滑肌收缩。MLCK作为一种多功能调节蛋白质，除具有磷酸化肌球蛋白20kD轻链的激酶作用外，N末端还具有与肌动蛋白结合活性和C末端与肌球蛋白结合的非激酶活性作用。MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收缩与舒张的调节过程中产生一定影响。为了更好地研究MLCK分子的非激酶作用以及激酶与非激酶两者的关系，本实验利用大肠杆菌表达系统大量表达并纯化出完整的MLCK分子，并对其ATP结合位点进行定点突变，获得无激酶活性的MLCK突变体。通过检测重组MLCK分子对磷酸化与非磷酸化肌球蛋白Mg<2+>-ATP酶(简称ATP酶)活性的作用及重组MLCK分子对体外肌丝运动速度的影响，进一步证明了MLCK的非激酶调节作用。本研究同时也为深入研究MLCK分子的多功能提供了新的思路和方法。
方法：利用编码MLCK全长的pCold I表达载体在大肠杆菌中进行表达；应用SDS-PAGE鉴定表达的重组MLCK分子；Glycerol-PAGE鉴定肌球蛋白磷酸化水平；运用亲和层析及凝胶过滤分离纯化重组的MLCK：应用孔雀绿方法检测重组MLCK对肌球蛋白ATP酶活性的影响；体外检测重组MLCK对肌动蛋白肌丝运动的作用(in vitro motilityassay)。
结果：实验结果显示重组MLCK(野生型)和MLCK/△ATP(突变型)在大肠杆菌中以可溶的形式大量表达；经CaM-Sepharose 4B和Superose6 HR纯化，SDS-PAGE鉴定得到单一的表达条带。Glycerol-PAGE显示重组MLCK(野生型)具有磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性；而MLCK/△
ATP(突变型)则失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性。应用孔雀绿方法测定不同浓度MLCK对非磷酸化与磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性的影响。结果表明：重组MLCK(野生型)和MLCK/ΔATP(突变型)均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性，抑制磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性，而且激活与抑制作用均随着MLCK浓度的增加而增大，呈量效关系。在体外肌动蛋白肌丝运动实验中，随着MLCK 浓度的增加，肌丝的运动速度呈明显递减趋势。重组MLCK (野生型)和MLCK/ΔATP(突变型)的比较表明二者在对肌球蛋白的ATP酶活性的作用上没有显著差异(P>0.05)。在体外肌动蛋白肌丝运动实验中，MLCK/ΔATP(突变型)对肌丝运动速度的抑制作用要强于重组MLCK(野生型)(P<0.05)。结论：本实验得出如下结论：1．重组MLCK(野生型)和MLCK/ΔATP(突变型)均可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达。2．SDS-PAGE结果显示重组全长MLCK可以通过亲和层析和凝胶过滤纯化得到单一的条带。3．Glyeerol-PAGE显示MLCK/ΔATP(突变型)失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性。4．重组MLCK(野生型)和MLCK/ΔATP(突变型)均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性，抑制磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性，二者的作用无显著性差异(P>0.05)。5．体外肌丝运动研究表明，重组MLCK(野生型)和MLCK/ΔATP(突变型)均可以抑制体外肌动蛋白肌丝运动的速度，MLCK/ΔATP(突变型)对肌丝运动速度的抑制作用较重组MLCK(野生型)更显著(P<0.05)。