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目的:痛风性关节炎严重影响了患者的生活质量,给家庭和社会都带来了巨大的压力和沉重的经济负担。蠲痹历节清方是我院协定处方,经过近二十年的临床应用,它对急性痛风性关节炎湿热瘀阻型的患者疗效显著。本次实验研究拟从整体水平和细胞水平着手进行研究,主要考察蠲痹历节清方在关节滑膜组织局部和巨噬细胞中调节TLR4/My D88细胞信号通路的能力,旨在证明蠲痹历节清方治疗痛风性关节炎的具体机制。方法:整体动物实验采用:大鼠48只,分为A、B、C、D共4组,每组12只。A代表正常对照组;B代表模型组;C代表蠲痹历节清方治疗组;D代表阳性药物依托考昔治疗组;建立大鼠膝关节痛风性关节炎模型,用蠲痹历节清方进行干预,以依托考昔作为对照药物进行对照,分别干预48h,分别于造模后即刻、造模后4h、12h、24h、48h测量大鼠膝关节周径并计算膝关节肿胀指数以观察膝关节肿胀改变情况;腹主动脉采血检测血尿酸水平改变;HE染色观察各组大鼠膝关节滑膜组织病理改变情况;免疫组织化学法检测各组膝关节滑膜组织中的TLR4、My D88、NF-κB蛋白含量;Western-Blot法检测各组膝关节滑膜组织中的PPAR-γ、IKK-β、IκB-α蛋白含量;RT-PCR检测各组膝关节滑膜组织中的TLR4 m RNA、My D88 m RNA的含量;ELISA检测大鼠关节滑膜组织中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1)的含量。并对抗痛风效应指标(关节肿胀指数和血尿酸)与TLR4/My D88信号通路主要效应指标进行相关性分析。体外细胞实验选用巨噬细胞株(J774.1),实验分为两部分:(1)不添加TLR4受体抑制剂部分;(2)添加TLR4受体抑制剂部分。每部分细胞随机分为4组,A组(正常对照组)、B组(模型组)、C组(蠲痹历节清方组)、D组(依托考昔组)。本研究通过在造模组培养液中加入尿酸钠混悬液干预,模拟炎症环境下建立巨噬细胞模型,制备蠲痹历节清方含药血清,并进行含药血清加入量的摸索,以MTT法摸索含药血清最佳干预加入量;使用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基+蠲痹历节清方含药血清,干预48h。通过Westen-blot法测定干预后各组巨噬细胞中My D88、IKK-β、IκB-α蛋白含量,RT-PCR测定干预后各组巨噬细胞中TLR4 m RNA、PPAR-γm RNA含量;ELISA测定干预后各组巨噬细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β含量;免疫荧光法检测巨噬细胞NF-κB蛋白含量并观察其活性(核移位)情况。结果:经连续腹腔注射氧嗪酸钾结合尿酸钠膝关节腔注射复合造模后,模型组(B组)与正常对照组(A组)比较,大鼠的一般情况变差;膝关节肿胀指数明显升高(P<0.05);光镜下膝关节滑膜组织炎症病理变化明显;关节滑膜组织中TLR4、My D88、NF-κB、IKK-β、IκB-α蛋白、TLR4 m RNA、My D88m RNA、TNF-α、IL-6、IL-1β表达含量明显升高(P<0.05);关节滑膜组织中PPAR-γ、IκB-α蛋白、TGF-β表达含量明显降低(P<0.05);C组经蠲痹历节清方干预治疗后,与模型组(B组)对比,大鼠的一般情况得到改善;膝关节肿胀指数明显降低(P<0.05);光镜下膝关节滑膜组织炎症病理变化得到改善;关节滑膜组织中TLR4、My D88、NF-κB、IKK-β、IκB-α蛋白、TLR4 m RNA、My D88 m RNA、TNF-α、IL-6、IL-1β表达含量明显降低(P<0.05);关节滑膜组织中PPAR-γ、IκB-α蛋白、TGF-β表达含量明显升高(P<0.05);D组经依托考昔治疗后,其结果与C组大致相当(除血尿酸水平外)。抗痛风效应指标与细胞信号通路主要效应蛋白表达的相关分析结果显示:PPAR-γ、IκB-α蛋白表达与关节肿胀指数(干预48h)之间存在负相关关系;TLR4、My D88、IKK-β、NF-κB蛋白表达与关节肿胀指数(干预48h)之间存在正相关关系;PPAR-γ、IκB-α蛋白表达与血尿酸之间存在负相关关系;TLR4、My D88、IKK-β、NF-κB蛋白表达与关节肿胀指数(干预48h)之间存在正相关关系。成功制备蠲痹历节清方含药血清后,MTT法进行含药血清加入量的摸索,结果经换算得出13.6%的蠲痹历节清方含药血清为其最佳干预加入浓度。巨噬细胞经尿酸钠盐模拟炎症反应环境造模后,模型组(B组)与正常对照组(A组)比较,显微镜下见培养的巨噬细胞呈明显的炎症反应改变;细胞模型中My D88蛋白、IKK-β、NF-κB蛋白、TLR4 m RNA表达含量明显升高(P<0.05);细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显升高(P<0.05);PPAR-γm RNA、IκB-α蛋白及细胞培养液中TGF-β含量明显降低(P<0.05);C组经蠲痹历节清方干预治疗后,与模型组(B组)对比,显微镜下见培养的巨噬细胞炎症反应改变得到改善;膝关节肿胀指数降低(P<0.05);光镜下膝关节滑膜组织炎症病理变化得到改善;细胞模型中My D88蛋白、IKK-β、NF-κB蛋白、TLR4 m RNA表达含量明显降低(P<0.05);细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显降低(P<0.05);PPAR-γm RNA、IκB-α蛋白及细胞培养液中TGF-β含量明显升高(P<0.05);D组经依托考昔治疗后,其结果与C组相似。同步使用通路阻断剂TAK-242(TLR4受体抑制剂)进行试验对照,结果显示:上述通路及其上下游各分子(因子)水平(TGF-β及PPAR-γ除外)均受到明显抑制。结论:经连续腹腔注射氧嗪酸钾结合尿酸钠膝关节腔注射的复合造模方法能够成功复制出大鼠痛风性关节炎模型;蠲痹历节清方能有效改善痛风性关节炎大鼠模型的一般情况、关节肿胀程度,降低血尿酸水平,有效改善滑膜组织的病理情况,从而起到抗痛风的作用。蠲痹历节清方能有效抑制炎症信号通路中TLR4、My D88、IKK-β、NF-κB蛋白在模型滑膜组织和巨噬细胞模型中的表达;并有效降低下游炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β在模型滑膜组织和巨噬细胞模型培养液中的含量;同时能够有效上调PPAR-γ、IκB-α、TGF-β在模型滑膜组织和巨噬细胞模型及培养液中的表达;抗痛风效应指标和TLR4/My D88信号通路相关指标之间存在一定的相关性。蠲痹历节清方能够在痛风性关节炎病程中起到调节TLR4/My D88细胞信号传导通路的作用,可能成为治疗痛风性关节炎的创新药物,值得进一步研究。