【摘 要】
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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是引起经济性反刍动物发生捻转血矛线虫病的重要寄生虫之一,寄生于皱胃以及肠道前端,可导致羊、牛等贫血、虚弱甚至死亡,严重影响养殖业的发展。驱虫药是捻转血矛线虫病的主要防治方法之一,但耐药性问题日益凸显,新型防控措施的研发是解决该问题的有效手段。已有研究证明益生菌能够有效控制病原体感染,特别是活益生菌可以改善胃肠道菌群的组成,减少病原体的定植。然
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（编号:2017YFD0501200）； 浙江省基础公益研究计划（编号:LGN20C180005）； 国家自然基金项目（编号:31602041）；
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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是引起经济性反刍动物发生捻转血矛线虫病的重要寄生虫之一,寄生于皱胃以及肠道前端,可导致羊、牛等贫血、虚弱甚至死亡,严重影响养殖业的发展。驱虫药是捻转血矛线虫病的主要防治方法之一,但耐药性问题日益凸显,新型防控措施的研发是解决该问题的有效手段。已有研究证明益生菌能够有效控制病原体感染,特别是活益生菌可以改善胃肠道菌群的组成,减少病原体的定植。然而,益生菌如何调节免疫反应以及保护宿主免受寄生虫感染仍然存在很多疑问。GAPDH蛋白是线虫体内重要的糖酵解酶,除此以外它还是一种重要的分泌排泄产物,能参与寄生虫的免疫逃逸过程。本研究对捻转血矛线虫感染湖羊皱胃微生物菌群进行测序分析差异菌群;进而通过芽孢表面展示技术构建表达HcGAPDH蛋白的重组枯草芽孢杆菌芽孢RSCotB-HcG;明确其在BALB/c小鼠模型中的免疫原性;通过在湖羊感染模型中检测重组芽孢诱发的细胞和体液免疫应答变化,探明对宿主带来的抗捻转血矛线虫感染的免疫保护作用。研究结果将为开发利用益生菌作为新型捻转血矛线虫病的控制手段奠定基础。为探究宿主胃肠道菌群与捻转血矛线虫感染的关系,收集来自不同感染阶段的湖羊皱胃粘液并进行16S rRNA测序,结果表明捻转血矛线虫感染后芽孢杆菌目微生物相对丰度显著降低。在此基础上,对于差异变化通过LEfSe分析结果表明,在未感染湖羊菌群结构中,芽孢杆菌目微生物的数量具有重要贡献作用,并且这种微生物丰度变化与捻转血矛线虫感染时间具有很强的相关性。研究在一定程度上阐明了芽孢杆菌目微生物丰度变化与捻转血矛线虫感染的关系。为评估芽孢杆菌是否能控制捻转血矛线虫感染,本研究利用表面展示技术构建重组益生菌芽孢RSCotB-HcG,将捻转血矛线虫HcGAPDH蛋白表达在枯草芽孢杆菌表面,结果显示重组芽孢能成功表达,且芽孢结构功能没有发生明显改变;利用免疫荧光技术和流式细胞术检测HcGAPDH蛋白在重组益生菌芽孢RSCotB-HcG表面成功表达,阳性率达到86.01%;利用透射电镜和扫描电镜检测重组益生菌芽孢的结构相对于野生型芽孢没有明显形态学差异。这为后续进行重组芽孢益生菌制剂动物试验奠定重要基础。为研究重组芽孢的免疫原性,利用BALB/c小鼠模型对不同剂量重组益生菌芽孢RSCotB-HcG在细胞和体液介导的免疫水平进行了探究,并采用MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖水平,利用ELISA方法检测IgG及其亚型IgG1和IgG2a的抗体水平,通过qRT-PCR方法检测不同细胞因子的表达情况。结果表明,重组芽孢在1 × 108 CFU剂量时,可引起小鼠产生最高水平的脾淋巴细胞增殖以及明显的特异性IgG抗体。通过ELISA检测IgG2a抗体水平是IgG1抗体的2.07倍,结合qRT-PCR技术对于多种Th-1、Th-2型细胞因子,转录因子的mRNA表达水平进行分析,表明重组芽孢引起以Th-1为主导的Th-1/Th-2混合免疫应答。对重组益生菌介导的免疫原性的分析,为后续研究其在捻转血矛线虫湖羊感染模型中的攻虫保护作用奠定良好基础。为评估重组益生菌芽孢RSCotB-HcG抵抗捻转血矛线虫感染的作用,构建湖羊感染模型开展攻虫保护试验。将重组芽孢以1 × 108 CFU、1 × 1010 CFU、1 × 1012 CFU的剂量免疫湖羊,分别利用MTT法、ELISA方法、qPCR检测湖羊外周血淋巴细胞增殖水平、特异性IgG抗体水平及不同细胞因子转录水平;免疫后7天进行攻虫,并评估湖羊体重变化以及粪便虫卵量、皱胃虫荷量,同时分析皱胃病理组织学变化。实验结果表明,重组益生菌芽孢的施用后诱导产生最高水平的外周血淋巴细胞增殖。抗体检测结果显示,重组益生菌芽孢RSCotB-HcG可以诱导明显的特异性IgG水平。通过qPCR技术检测不同细胞因子的转录水平,结果显示施用重组芽孢的外周血淋巴细胞的Th-1型细胞因子转录水平都显著升高。体重评估结果表明相对于单纯感染捻转血矛线虫的湖羊来说,施用重组芽孢后感染的湖羊体重下降明显减少,同时H&E染色不同组皱胃组织也发现炎性损伤明显减少。虫荷量减少84.1%,虫卵量减少71.5%。探究重组芽孢的攻虫保护作用机理,为制定有效的免疫防治策略提供重要参考。综上所述,本研究分析了捻转血矛线虫感染与湖羊皱胃微生物菌群的关系,构建了表面表达HcGAPDH蛋白的重组芽孢RSCotB-HcG,分析了其在BALB/c小鼠模型中的免疫原性,阐明了诱导的免疫应答方式,并在湖羊感染模型中评估其抗虫保护作用,进一步分析了重组芽孢抗捻转血矛线虫感染的保护机制。本研究对利用重组益生菌控制捻转血矛线虫感染的研究奠定良好基础,为后续研究捻转血矛线虫新防控措施、疫苗开发等提供重要参考。
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