论文部分内容阅读
木聚糖是植物半纤维素的重要成分，是自然界中仅次于纤维素含量第二丰富的可再生资源。木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中β-1，4木糖苷键的酶系，可将木聚糖水解为低聚木糖、木寡糖、木二糖、以及少量阿拉伯糖和木糖。因此木聚糖酶被广泛应用于生物能源、食品、饲料、制药、制浆、造纸、纺织等行业中，已成为国内外众多学者的研究热点。衡量酶生物活性的重要标准是酶活力，目前常用的活力测定方法是DNS法，该法虽然操作简单、精密度高，但灵敏度低，无法检测酶反应初速度，无法检测微量木聚糖酶活力。本文建立了3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法已将其应用于木聚糖酶活力的测定，但将其应用于基质中木聚糖酶活力的测定是首次，因此本文首先对MBTH法测木聚糖酶活力进行了优化并与DNS法进行了比较。并将其应用于饲料中木聚糖酶活力的测定，联合高通量分析手段，可一次性准确快速的处理大量样品，因此该法将会在各个领域得到广泛的应用。本论文主要包括以下研究内容： 1.建立了MBTH法测酶解产物还原端基的新方法 首先对还原糖测定条件进行了参数优化，其次建立还原糖标准曲线以及与DNS法进行比较，最后研究了高浓度木糖含量的测定方法，并进行了方法验证，结果表明：MBTH法灵敏度高于DNS法10倍以上，且精密度、准确度都较高；在还原糖浓度较高的情况下，可以进行适当稀释后，对照稀释后的还原糖标准曲线计算还原糖的量。 2.对MBTH法与DNS法测木聚糖酶活力进行了比较 对MBTH法测木聚糖酶活力进行了优化并与DNS法进行比较。首先对底物、酶解温度进行了研究，其次与DNS法在酶解动力学及酶浓度对反应速率的影响进行了比较，最后在检测限、灵敏度等方面进行了方法验证。结果表明：木聚糖酶与桦木木聚糖亲和力较大，最适底物浓度为4 mg/mL，酶解温度为30℃，当酶含量较少时可选37℃；MBTH法(DL=0.0090μg/mL)在灵敏度和准确度方面都远远优于DNS法(DL=0.107μg/mL)。因此，MBTH法特别适合于木聚糖酶活力的定量测定。 3.MBTH法在饲料基质中酶活力测定的应用研究 对MBTH法在饲料木聚糖酶活力测定进行了研究。首先对饲料中酶的提取方法进行了研究，其次对酶解温度进行优化并建立了饲料中的酶浓度曲线，最后MBTH法测几种饲料样品酶活力并进行方法验证。结果表明：饲料酶的最佳提取方式为缓冲液低温条件下(4℃)电磁搅拌溶解，离心取上清液；饲料中酶活力的最适酶解温度为37℃；MBTH法可准确测定饲料中微量木聚糖酶活力，且具备良好的准确度灵敏度和精密度。 4.高通量分析在饲料酶活力测定中的应用研究 运用MBTH法联合高通量分析手段测定饲料中木聚糖酶活力。首先对MBTH法在微孔板体系中的运用进行了方法优化，确立了各项酶解参数；其次MBTH法与微孔板测定手段相结合测定饲料中的酶活力；最后进行方法验证。结果表明：高通量分析法中MBTH法的酶解参数与试管法稍有差别，酶浓度曲线的斜率(6.14)和试管法(6.11)基本一致；高通量分析法在测定饲料酶活力时有较低的检测限(0.190μg/mL)和定量限(0.632μg/mL)，且准确度很好，因此可进行基质中酶活力的测定；该法一次可处理大量样品，所用试剂量少，减低检测成本。