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高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)广泛存在于小麦及其近缘种中,是决定小麦面粉加工品质的重要因子。本文从不同角度对小麦及其近缘种的HMW-GS进行了研究,研究内z容包括以下3个部分:(1)小偃54 HMW-GS突变体的突变机理及其对加工品质影响的研究；(2)冰草HMW-GS基因的克隆及结构特征分析；(3)假鹅观草HMW-GS基因Glu-1St1的遗传转化。
对70个来自EMS诱变的普通小麦品种小偃54的HMW-GS突变体,包括单亚基缺失突变体65个和SDS-PAGE迁移率发生变化的突变体5个,重新进行了SDS-PAGE检测。然后对所有HMW-GS突变体的相应突变基因及其突变位点进行了分析。结果表明,所有HMW-GS突变基因均在编码区发生了1或2个点突变,从而引起提前终止密码子的产生或氨基酸残基的替换,最终导致HMW-GS缺失或电泳迁移率变化。根据突变发生的位点和碱基的替换类型,可将70个突变体归为26种突变类型,其中亚基缺失突变体22种(1Ax1亚基缺失1种,1Bx14亚基缺失4种,1By15亚基缺失3种,1Dx2亚基缺失10种,1Dy12亚基缺失4种),SDS-PAGE迁移率发生变化的突变体4种(1Ax1亚基电泳迁移速率变慢、变快、1Dx2亚基电泳迁移速率变快和1Dy12亚基电泳迁移速率变慢各一种类型)。
26种HMW-GS突变类型共涉及到29个突变事件,并且全部为碱基转换(transition),其中23个(79.3％)为C/T转换,6个(20.7%)为G/A转换。从突变结果来看,29个突变事件中有22个(75.86%)产生了终止密码子,只有7个(24.14%)发生了碱基替换。由此可见,C/T。转换是EMS诱变HMW-GS基因突变的主要类型。由C/T转换产生终止密码子的突变过程分别为CAA到TAA(17个,77.27%)和CAG到TAG(4个,18.18%),由G/A转换产生终止密码子的突变过程为TGG到TGA(1个,4.55%)。可见密码子水平的主要突变类型是C/T转换引起的CAA到TAA。究其原因可能有两个,一个是EMS的诱变原理主要是引起GC碱基对到AT。碱基对的替换。另一个是在HMW-GS基因序列中CAA密码子的比例(23.4%)显著高于CAG(10.0%)和TGG(0.9%),因此突变发生在CAA密码子C碱基上的比例较高。
在检测到的4种SDS-PAGE迁移率发生变化的HMW.GS突变类型中,两种电泳迁移率变慢的突变类型(1Ax1和1Dx12)都是甘氨酸残基(G)突变成谷氨酸残基(E),而在两种电泳迁移率变快的突变类型中,一种是(1Ax1)发生了谷氨酸(E)到赖氨酸(K)和甘氨酸(G)到精氨酸(R)两个氨基酸残基的替换,而另一种(1Dx2)是丝氨酸残基(S)到苯丙氨酸残基(F)的替换。由此推测谷氨酸残基(E)可使HMW-GS的SDS-PAGE迁移率变慢,而苯丙氨酸残基(F)可能会使HMW-GS的SDS-PAGE迁移率变快。
对5个缺失不同。HMW-GS的小偃54突变系进行了品质分析。结果表明,缺失任何一个亚基的突变体,其籽粒硬度、蛋白含量、面筋含量和吸水率都没有发生显著变化。说明HMW-GS之间或HMW-GS与其它储藏蛋白之间存在着非常强的补偿作用。相反,任何一个亚基的缺失都使与面筋强度或延展性相关的参数发生了明显改变。在5个亚基中,缺失1By15亚基对面筋强度的影响最大,而缺失1Dx2亚基对面团的延展性影响最大。
从二倍体冰草(Agropyron cristatum,PP,2n=2x=14)中克隆了4个HMW-GS基因Glu-1Pdx1(1443bp)、Glu-1Pdx2(1740bp)、Glu-1Pdy1(1494bp)和Glu-1Pdy2(1665bp),其中3个基因具有完整的ORF,而Glu-1Pdy2序列中有一个无义突变。氨基酸序列分析表明,这4个冰草的HMW-GS具有与小麦HMW-GS相同的一级结构,即由信号肽(在成熟蛋白中被切除)、保守的N-端、C-端和中间重复区构成,但也有明显不同于小麦HMW-GS的特点:(1)冰草的HMW-GS基因都比较小,均在1.8kb以下。尤其是在偏x-型的Pdx1亚基分子量小于来自同一植株的两个偏y-型亚基Pdy1和Pdy2。可见冰草的x-型和y-型亚基在长度上分化不明显;(2)Pdy1和Pdy2亚基的N-末端与y-型亚基聚为一类,而C-末端却与x-型亚基聚为一类;相反,Pdx1亚基的N-末端与x-型亚基聚为一类,而C-末端却与y-型亚基聚为一类。表明这3个亚基都不是典型的x-型或典型的y-型HMW-GS。推测冰草的Glu-1位点在进化上可能处于比较原始的状态;(3)在小麦及其许多近缘种中,GQQ三肽是x-型亚基所特有的,一般每个x-型亚基的中间重复区都有多个GQQ三肽。但冰草的Pdx1和Pdy1亚基都有一个三肽,这可能是x-型亚基和y-型亚基发生分化的一个证据;(4)在小麦中,部分y-型亚基的中间重复区靠近C-端区有一个半胱氨酸残基,而在x-型亚基中只在1Dx5的中间重复区靠近N-端区有一个半胱氨酸残基。冰草的Pdx1亚基在中间重复区靠近C-端区出现两个半胱氨酸残基,Pdx2亚基在靠近N端保守区有一个半胱氨酸残基,且与小麦1Dx5亚基的位置相同。这些亚基为研究半胱氨酸残基的数目及位置对小麦加工品质的影响及品质改良提供了新基因资源。
将假鹅观草(Pseudoroegneria stipofolia)的HMW-GS基因Glu-1St1与Bar基因通过基因枪法共转化高产小麦品种科农199,获得了6个转基因株系,转化率为0.46%。通过PCR、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS、FISH实验证明,Glu-1St1基因已经整合到科农199的基因组中,且能在胚乳细胞中表达。同时发现,在部分转基因株系中,St1亚基的表达不同程度地影响了内源HMW-GS的表达。Bar基因检测表明,在转基因T2代植株中已分化出部分没有报告基因的转基因株。