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本文以大肠杆菌lacI基因作为突变谱研究的目的基因,通过和已有数据的比较,对离子注入导致活细胞的突变机理、离子注入的真空干燥条件对细胞突变的影响和机理及对离子注入生物效应的贡献进行了研究。主要研究内容和结果如下:
⑴简化和优化了P-gal筛选平板。P-gal筛选方法是筛选lacI-突变子最常用的方法,其制备需要高纯度的琼脂和用lacZ-菌吸收P-gal平板上其它可利用糖源,因此在制备平板时费工费时。本文选择琼脂糖作为筛选平板的介质,通过比较琼脂糖与琼脂中还原糖的含量以及三种P-gal筛选平板(P-gal agarose、P-gal agar、P-gal agar scavenged)筛选的自发和离子注入诱发的突变率、筛选平板上可见菌落随时间变化、筛选结果在鉴定平板上的鉴定结果和测序结果,说明以琼脂糖作为筛选平板的介质虽然直接成本较高,但提高了筛选准确性、简化了筛选平板的制备、节约了时间,是一种有效的方法。
⑵摸索出了用X-gal鉴定平板上鉴定lacl突变子的有效方法。通常lacI+、lacI和lacOc可以通过X-gal鉴定平板鉴定。在一定时间内,lacI+为白色菌落,lacOc为浅蓝色菌落,lacI为深蓝色菌落。但是,在实际鉴定过程中,筛选条件的一致、观察时间的掌握、颜色深浅的把握实际上是比较困难的。本文通过筛选时间的确立,设立阳性对照并将待测突变子与阳性对照放在同一培养皿中培养等方法来鉴定突变子,提高了鉴定准确性。
⑶通过对离子注入、真空干燥对照、自发突变三组的突变率和突变谱比较,本文发现离子束的真空干燥条件诱发的突变率为2.6×10-6,是自发突变率(1.5×10-6)的1.7倍,是筛选剂量31.2×1014ions/cm2处突变率(26.3×10-6)的0.083倍。说明离子注入的真空干燥条件可以诱发大肠杆菌细胞一定的突变,但对离子束突变效应只有很小的贡献。
⑷证明了真空干燥引起的SOS反应,是离子注入的真空干燥对照组引起细菌突变的主要诱导因素之一。从真空干燥对照组与自发突变组的突变谱比较,本文发现真空干燥对照组的增加部分与SOS反应诱发的突变谱比较一致,因而提出真空干燥对大肠杆菌的诱导作用主要是由SOS反应介导的。并证明了真空和干燥对细菌SOS反应的诱导,验证了离子注入的真空和干燥条件主要通过SOS反应诱发大肠杆菌突变。
⑸分析了离子注入导致大肠杆菌突变的可能机理。比较了lacI基因由离子注入、真空对照、自发突变及其他辐射诱变的突变谱,分析了离子注入导致大肠杆菌突变的可能机理。低能氮离子注入可以诱发lacI基因几乎所有的突变类型,包括突变热点+TGGC或-TGGC(48%),各种类型的碱基置换(33%),单碱基插入(9%),单碱基缺失(3%),多碱基缺失(5%)和IS1插入(2%)。本文得到的突变谱与自由基诱变相同菌株的突变谱基本相似,说明自由基是低能氮离子注入引起大肠杆菌lacI基因突变的主要原因。与自发突变和真空干燥对照比较发现,离子注入引起单碱基置换、缺失、插入显著增加,其中单碱基置换是自发突变的3.3倍,是真空干燥对照的1.4倍;单碱基插入和缺失从0%增加到12%。通过比较绝对突变率发现,尽管突变热点+TGGC或-TGGC的突变比例从82%下降到48%,但其绝对突变率却增加了大约10倍,其中+TGGC增加了58倍,说明低能离子注入可以引起lacI基因突变热点的突变。先前的研究认为lacI基因突变热点+TGGC或-TGGC形成的主要原因是脱碱基位点(AP)产生。本文的结果支持低能氮离子注入引起大肠杆菌基因组产生脱碱基位点(AP),进而引起lacI基因突变热点+TGGC或-TGGC形成。比较了低能离子活体注入和胞外注入的区别,从碱基置换的类型(本文G∶C/A∶T为20/14;Q.Wang et al G∶C/A∶T为48/5)到插入缺失比(本文不包括±TGGC的插入/缺失为6/5,包括TGGC的插入/缺失为42/7;Q.Wang et al插入/缺失为2/39)都存在明显不同,说明低能离子直接注入胞外质粒的突变机理和注入活细胞的突变机理明显不同。另外,本文还比较了低能离子注入和γ-射线辐射lacI基因突变谱,结果显示γ-射线辐射引起的突变主要是碱基置换,其碱基置换的比例明显高于低能离子注入,而低能离子注入则主要引起lacI基因突变热点的突变,γ-射线辐射无论胞外质粒还是基因组基因都很少引起lacI基因突变热点的突变。这一结果说明尽管这两种辐射都间接作用于DNA,但仍然有一定的区别。低能离子注入除了会形成自由基外,可能还有另外的致突变机理,如离子注入的质量沉积效应或离子注入比较容易形成加合物,导致滑移突变增加,尤其是在lacI基因突变热点处的突变。
⑹在离子注入和真空干燥对照组还发现三个发生在同一个位点(276-279)的CAGC缺失突变。非常有趣的是,这种突变类型是以前lacI突变谱没有报道过的,是不是低能离子诱发的特有突变类型或者是低能离子注入诱导的突变热点还有待更多的实验证据来证明。