【摘 要】
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猪δ冠状病毒(Porcine Deltacorconavirus,PDCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、δ冠状病毒属的新成员,因其导致仔猪高发病率和快速传播特征而得到全世界的广泛关注。核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)作为冠状病毒的主要结构蛋白,在病毒的复制和免疫调节中发挥重要作用。它能够与核酸结合,从而起到保护病毒基因组免受细胞外
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猪δ冠状病毒(Porcine Deltacorconavirus,PDCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、δ冠状病毒属的新成员,因其导致仔猪高发病率和快速传播特征而得到全世界的广泛关注。核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)作为冠状病毒的主要结构蛋白,在病毒的复制和免疫调节中发挥重要作用。它能够与核酸结合,从而起到保护病毒基因组免受细胞外因子侵害的作用。同时N蛋白还在病毒复制和亚基因组病毒RNA转录过程中起着非常关键的作用。目前关于α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和β冠状病毒属的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)的研究较多,但是对δ冠状病毒属的N蛋白研究相对较少。本研究主要从以下方面研究N蛋白转运入核的机制,为进一步了解δ冠状病毒属病毒N蛋白提供理论研究基础。本研究构建了PDCoV N蛋白表达质粒,在真核LLC-PK1细胞中验证其能正常表达,间接免疫荧光和共聚焦试验发现N蛋白可以完全定位于细胞质,但少部分蛋白呈现细胞质和细胞核仁同时定位的现象。通过抗N蛋白的单克隆抗体验证了病毒感染情况下N蛋白定位情况与超表达情况一致。后续,我们通过http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/网站预测、构建缺失突变体,同时通过间接免疫荧光发现C端的295-318氨基酸位点对N蛋白核仁定位至关重要。N蛋白进入细胞核仁需要核转运家族蛋白协助跨过核膜。为探寻N蛋白核转运过程中所依赖的核输入蛋白,我们扩增了猪源α家族核转运蛋白importinα1、importinα3、importinα4、importinα5、importinα6、importinα7和importinα8,并通过免疫共沉淀方法分析,发现PDCoV N蛋白不能够与importinαs发生相互作用。这些研究将揭示PDCoV N蛋白细胞核转运的分子机制,为后续阐明N蛋白功能奠定理论基础。
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