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背景肝衰竭是国际性的治疗难题。人工肝尤其是以培养肝细胞为基础的生物人工肝的不断发展与成熟为肝衰竭的治疗开辟了新的途径。到目前为止,国内外已有数个生物人工肝系统进入到Ⅰ-Ⅲ期临床试验,但将其应用到临床并推广使用,还存在诸多问题有待解决。其中首要问题是如何获得足够数量、高活性并且功能良好的肝细胞。因此,生物人工肝对肝细胞培养的规模和质量提出了更高的要求。目前已有多种培养技术被应用到生物人工肝的研究中,如微囊化培养、微载体培养、反应器培养,流化培养及共培养等技术。为了扬长避短,多种培养方式结合可能更有利于维持或提高肝细胞的功能和活性。本实验室前期已成功构建了基于微囊悬浮型流化床式反应器的新型生物人工肝系统,体外及动物实验的初步结果是我们相信微囊悬浮流化床式反应器能够为肝细胞大规模、高活性培养提供可靠的技术支持。目的本课题根据新型生物人工肝系统对肝细胞培养的要求,采用微囊化培养、共培养及流化培养技术相结合,旨在为新型生物人工肝提供足量高活性、功能良好的肝细胞。方法1.确定制备微囊的稳定条件,全面评价微囊的机械强度、物质通透性以及微囊内细胞的活性,为下一步的研究打下基础。2.构建基于微囊流化床式反应器的培养系统,以单层贴壁培养(2D)为对照,采用微囊静态培养(3D)、微囊共培养(3D-Co)、微囊流化培养(3D-F)、微囊流化共培养(3D-F-Co)等四种培养模式培养肝细胞,评价在不同模式下肝细胞的合成能力和药物代谢能力。3.采用蛋白质芯片、Realtime-PCR、Western Blot等技术初步研究肝细胞功能改变的机制。结果1.确定了两种不同直径(800μm,300μm)微囊的稳定制备条件,制备的微囊具有良好的机械强度和物质通透性,微囊化的肝细胞在培养过程中保持很高的活性。2.不同培养模式下肝细胞功能评价结果显示：微囊化培养相比单层贴壁培养优势明显；微囊共培养能够显著提高肝细胞的白蛋白合成能力和CYP1A2的活性；微囊流化培养能够显著提高肝细胞的合成能力和CYP1A2的活性；流化共培养在提高肝细胞的CYP3A4、CYP1A2的活性方面效果最显著。3. HepLi3细胞功能与肝肿瘤细胞系相近,微囊流化培养系统能够显著提高其合成功能和CYP3A4、CYP1A2的活性。4.蛋白芯片分析显示hPMSC细胞能够分泌多种细胞因子参与调节肝细胞的增殖、凋亡和功能的发挥；Realtime-PCR结果显示微囊化培养和共培养可显著提高肝细胞功能相关基因的表达水平；Western Blot结果显示肝细胞CYP2E1、CYP1A2的蛋白表达量增高,微囊流化共培养能够显著下调肝细胞内PKC,ERK及PKA的磷酸化水平及钙调蛋白的表达水平。结论1.基于微囊悬浮型流化床式反应器的培养系统能够维持并提高肝细胞活性和功能；微囊流化共培养为最佳的肝细胞培养模式。2.肝细胞功能的提高可能与间充质干细胞的旁分泌效应以及多条功能相关的磷酸化通路受到抑制有关。