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龙胆苦苷(Gentiopicroside)为裂环环烯萜苷类化合物,具有保肝利胆、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、健胃、抗溃疡等药理作用。用龙胆苦苷研究开发新药具有良好的应用前景,但随着龙胆苦苷的开发利用,其来源问题突现。本论文选用秦艽为研究材料,尝试采用植物细胞悬浮培养的方法生产龙胆苦苷,以期解决龙胆苦苷的来源问题。
本论文以龙胆苦苷积累量为指标,以高效液相色谱法为分析手段,研究了高产细胞系的筛选、培养条件的优化;研究了细胞生长、龙胆苦苷积累及主要营养成分的消耗关系与规律。研究结果如下:
1.采用紫外诱变--小细胞团法筛选得到高产龙胆苦苷的细胞系UV-4-b,该细胞系龙胆苦苷含量为0.242mg/g,比筛选前提高了64.63％。
2.本论文细胞种龄、装液量影响的试验结果,结合前期课题组研究,得到最佳悬浮培养条件为:MS为基本培养基、初始pH7.0、30g/L蔗糖为碳源、接种细胞种龄为15d,装液量为40％～50％,25℃、110r/min下暗培养。
3.诱导子对秦艽悬浮细胞影响结果表明:100mg/L黑曲霉诱导子及20mg/L蜜环菌诱导子,使龙胆苦苷含量比对照组分别提高了12.3％、13.7％,产量分别提高了23.99％、9.06％。米曲霉诱导子及酵母菌诱导子对秦艽细胞生长及龙胆苦苷的积累都有明显的抑制作用。
4.秦艽悬浮细胞的生长受初始蔗糖、氮、磷浓度的影响。不同蔗糖浓度影响细胞的指数生长期持续时间,从而影响最大生物量;不同氮浓度影响细胞延滞期持续时间;不同磷浓度影响细胞生长形态,高磷浓度(2.5mmol/L及5mm01/L)对于细胞生长不利。适合细胞生长的蔗糖浓度为:30～50g/L,氮浓度为60mmol/L,磷浓度为0.625～1.25mmol/L。
5.秦艽悬浮细胞中龙胆苦苷含量呈现两阶段积累的情况。龙胆苦苷积累与细胞生长有关,符合延滞期越短,龙胆苦苷开始积累越快的规律,且最高龙胆苦苷含量,符合细胞生物量越高,龙胆苦苷含量越低的规律。
6.糖的消耗与细胞生长有关,高氮(120mmol/L)、高磷(5mmol/L)浓度下,细胞对糖的吸收较慢;细胞对硝态氮及铵态氮的吸收不同步,在延滞期迅速利用铵态氮,而硝态氮在指数生长期时才快速消耗;细胞在延滞期快速吸收无机磷,且细胞生长快,磷吸收快。