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目的： 探究单宁酸对4种临床常见菌株的抗菌活性，分析其对非多重耐药临床菌株和多重耐药临床菌株抗菌活性的差异;观察单宁酸对上述细菌生物膜形成的影响，探究其抗菌机制和影响生物膜形成的原因，为临床治疗多重耐药细菌引起的感染提供新的策略。 方法： 1.回顾性分析2014年1月至6月间温州医科大学附属第一医院临床分离的革兰阳性菌中的金黄色葡萄球菌、屎肠球菌以及革兰阴性菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的耐药状况。根据药敏结果将上述4种菌株各分为多重耐药组和非多重耐药两组，共8组。每组选取30株菌，共240株，进行下一步的实验。 2.单宁酸抗菌活性检测:采用琼脂稀释法检测单宁酸对上述菌株的最低抑菌浓度(MICs)。评估单宁酸对多重耐药菌株和非多重耐药菌株的抗菌活性差异。 3.单宁酸时间杀菌相关实验:菌株过夜培养后，将细菌悬液浓度稀释到1X105CFU/ml，分组开始进行培养，每组培养基里添加不同浓度(0.5×MIC，1×MIC，2×MIC)的单宁酸溶液，并设置空白对照，开始培养，分别于0h，1h，2h，4h，8h，16h，24h，吸取一定的菌液进行菌落计数。根据CFU计数的结果，绘制细菌生长曲线和杀菌曲线;在单宁酸时间杀伤曲线的实验的培养基中加入不同成分的细胞壁成分，观察添加物对杀菌曲线的影响。 4.单宁酸对上述细菌结合率的检测:离心收集过夜培养的细菌，用PBS缓冲液冲洗三次后，分别在含有不同浓度单宁酸的PBS溶液里，加入相同浓度的细菌悬液，在37℃孵育1h离心收集菌体，取上清液测量剩余溶液中单宁酸的浓度。根据下面的公式，计算出单宁酸对不同细菌的结合率。结合率=（初始浓度-最终的浓度）/初始浓度×100％ 5.细胞壁稳定性试验:过夜培养菌株，离心收集菌体，分布用一定浓度的单宁酸处理6h后，再用PBS缓冲液清洗3次，吸光度T0调至OD600=1.0，加入500μg/ml的溶菌酶，37℃，100rpm培养6h。培养结束后检测吸光度值T。根据公式:溶解率=(ODT0-ODT)/ODT0×100％，溶解率越高表明细菌的细胞壁越不稳定。 6.透射电镜实验:将细菌悬液浓度调整至相同浓度(1X105CFU/ml)后，在培养基中加入单宁酸，使其终浓度为其MIC值，过夜培养细菌，离心收集菌体，使用透射电子显微镜(TEM)观察细菌细胞壁的变化。 7.单宁酸影响生物膜形成实验:在96孔聚苯乙烯细胞培养板上进行不同细菌生物膜实验，在生物膜培养基里加入不同浓度的单宁酸，检测其对生物膜形成的影响。最后在扫描电子显微镜(SEM)下观察单宁酸对细菌形成生物膜形成的影响。 8.生物膜形成初期黏附菌落数量检测试验:在6孔培养板中，分别加入不同浓度的单宁酸溶液，并设置空白对照。在生物膜培养开始2h后，充分振荡，吸取弃掉上清液及浮游菌株后，在培养孔中添加新的无菌培养基，培养2h，混匀后进行菌落计数。观察加入单宁酸的培养基的菌落计数(CFU)与普通培养基的CFU的差异。 结果 1.单宁酸对4种常见的临床分离菌均有一定的抗菌活性，且对多重耐药组与非多重耐药组的抗菌活性相似。对革兰阳性菌的抗菌活性大于对革兰阴性菌的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强。 2.单宁酸明显抑制细菌生长的阶段是在细菌的对数生长期。肽聚糖对单宁酸的抗菌活性抑制作用最大。 3.单宁酸对金黄色葡萄球菌的结合率高于对肺炎克雷伯菌的结合率。 4.加入单宁酸之后，细菌的溶解率上升，细菌的细胞壁易被溶菌酶分解，细胞壁稳定性下降。 5.透射电镜结果表明，细菌的细胞壁不完整，结构破坏，细胞质内部结构紊乱。进一步表明单宁酸可以抑制细菌的生长。 6.不同种类的细菌生物膜形成能力有一定的差异，其生物膜形成与耐药性并不成相关性，与标本来源也不成相关性。一定浓度的单宁酸溶液可以抑制多重耐药和非多重耐药细菌生物膜的形成， 7.生物膜培养基中添加单宁酸后，生物膜形成初期黏附的细菌数量减少。 结论 1.单宁酸不仅可以抑制临床上金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的生长，还可以抑制其多重耐药细菌的生长。 2.单宁酸抗菌机制主要是破坏细胞壁的稳定性，抑制细菌细胞壁的形成，对单宁酸进行进一步深入的研究有助于为使用单宁酸作为临床抗菌物质提供实验依据。 3.单宁酸能一定程度降低细菌生物膜的形成，抑制生物膜形成的机制是抑制生物膜早期细菌对附着物的黏附。