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核苷转运蛋白在哺乳动物和高等植物拟南芥中已有系南芥核苷转运蛋白AtENT1和AtENT3的研究。水稻的两个核苷转运蛋白(OsENT1、OsENT2)在一级结构上与已发表的核苷转运蛋白(来自于拟南芥和哺乳动物)具有显著的相似性,并且都具有十一个可能的跨膜区。进化分析证明OsENT1、OsENT2统和深入的研究。这类蛋白调控核苷或其类似物的跨膜转运,被转运的核苷化合物通过挽救途径参与核苷酸的生物合成并对人类疾病的治疗和植物生长发育的调节起重要作用。本论文的研究是在拟南芥和哺乳动物核苷转运蛋白研究的基础上,对水稻扩散型核苷转运蛋白的一级结构、表达模式、亚细胞定位与转运活性进行了研究;并对拟南芥扩散型核苷转运蛋白转运细胞分裂素的活性和核苷转运蛋白在体内的生物学功能进行了探讨。
我们实验室在2000年和2003年分别报道了对拟与拟南芥的核苷转运蛋白有更相近的进化关系。在酵母或洋葱表皮细胞中表达GFP:OsENT的融合蛋白,发现OsENT1定位于细胞质膜上,而OsENT2在整个细胞中都存在。利用半定量RT-PCR技术对四个OsENT基因在水稻根、茎、叶、花和穗中的表达特异性进行了研究。在根、茎、叶、花和穗中,OsENT1都有表达,在叶和穗中表达较强,而OsENT2只在根和穗中有比较强的表达,OsENT3在根、茎、叶中有表达,OsENT4在根、茎、叶、花和穗中都有比较强的表达。在不同的水稻衰老叶片中,OsENT1随叶片的衰老,表达量上升。在水稻种子不同的萌发时期,OsENT1的表达量逐渐增强,在第6天时,表达量最高,随后逐渐降低。
利用酵母缺失突变体,建立了研究重组水稻核苷转运蛋白转运活性的实验体系。利用该系统我们发现,OsENT1能以高亲和机制转运腺苷、次黄苷、尿苷、胞苷和胸苷,转运腺苷、尿苷和胸苷的KE分别为3.6μM,2.9μM和3.5μM。OsENT2没有发现转运活性。OsENT1转运核苷依赖于膜两侧H+电化学势的存在,并且随着外界pH的降低,转运活性增强,CCCP、DNP可以消除OsENT1的转运活性。OsENT1对NBMPR、Dilazep、Dipyridamole不敏感,竞争实验证明OsENT1能转运各种核苷和2’-脱氧核苷,但不能转运碱基和核苷酸。
拟南芥核苷转运蛋白AtENT3和AtENT8在酵母中表达,具有转运反式玉米素核苷的功能。通过T-DNA插入突变体研究拟南芥核苷转运蛋白在体内的功能发现,AtENT3是拟南芥根部吸收尿苷、胞苷重要的有功能的核苷转运蛋白,而AtENT1,AtENT6等其它AtENT则几乎没有体现这种功能。根吸收的尿苷主要渗入到RNA的合成中去。AtENT1、AtENT3、AtENT6在拟南芥根对腺苷的吸收过程中都发挥功能。但并没有发现对胸苷吸收有功能的核苷转运蛋白,说明不同AtENT成员在拟南芥中有功能上的分工。
本项研究过程中所获得的结果和积累的资源对于进一步比较分析两种模式植物(水稻和拟南芥)中扩散型核苷转运蛋白的功能具有促进作用。