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目的:牵张成骨具有骨折愈合不可比拟的成骨速率,但至今其成骨机制尚未明了。课题组在前期研究中发现内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面标记物CD133在牵张成骨新骨区域具有较高的表达,期间可能存在EPCs参与的血管发生机制;并且,利用高通量测序技术对牵张成骨区域、胚胎骨、骨折断端等组织的miRNAs进行表达量聚类分析,发现miRNA-21,miRNA-10,miRNA-451,mi RNA-27b,mi RNA-486,miRNA-205在牵张成骨区域及胚胎骨中具有共同表达。因此,我们推测上述miRNAs可能通过调控靶基因进而调控EPCs血管发生,从而促进新骨形成。本实验拟从miRNA的角度初步探索EPCs成血管分化机制。方法:1.EPCs体外分离培养、鉴定及成血管能力检测的研究:抽取3W龄幼犬骨髓约5ml,采用密度梯度离心法分离获取EPCs后:(1)通过倒置像差显微镜下观察EPCs的形态学特点;(2)通过流式细胞仪检测EPCs表面标志物;(3)通过细胞周期流式分析检测EPCs增殖能力;(4)通过Transwell迁移实验及细胞划痕实验检测EPCs迁移能力。2.筛选调控EPCs成血管分化的miRNAs及其生物信息学分析:对EPCs进行成血管诱导1,3,7,10,14,21和28d,设置诱导前细胞株为“0d”组,进行qRT-PCR检测分析miRNA-10,miRNA-451,miRNA-486,miRNA-21,miRNA-205,mi RNA-27b的动态相对表达量;同期进行检测分析VEGF-A,bFGF的动态相对表达量,观察miRNAs与VEGF-A,bFGF表达趋势,通过统计学方法分析比较6个miRNAs与VEGF-A,bFGF表达的相关性,挑选出EPCs在成血管过程中可能存在调控作用的miRNA;进一步通过生物信息学对相关的miRNA进行靶基因预测、GO富集和KEGG Pathway分析。3.EPCs在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达:取EPCs完全随机分为4组,如下所示:A:静态培养;B:加载离心力24 min(100r/min),每天4次,刺激3 d后停止培养;C:加入成血管诱导液诱导3d后终止诱导;D:加入成血管诱导液进行成血管诱导(参照C)并进行机械力刺激(参照B)3d后停止培养。上述4组于特定时间点进行qRT-PCR及WB检测Wnt信号通路相关基因及血管形成标志物VEGF-A的表达。结果:1.EPCs体外分离培养、鉴定及成血管能力检测结果:(1)EPCs的形态学观察:EPCs贴壁生长后,随着培养时间的推移,细胞两端逐渐伸展出纺锤形伪足,细胞之间相互首尾连接,胞体形态亦逐渐发生改变,出现大量的梭形细胞,呈集落式聚集为条索状结构,最终呈圆环样结构,具有明显的管倾向。(2)EPCs中可检测出与ECs不表达的表面标记物CD133。(3)Transwell迁移、细胞划痕实验证明EPCs具有迁移、趋化能力。2.筛选调控EPCs成血管分化的mi RNAs及其生物信息学分析:EPCs在成血管分化过程中,microRNA-486,micro RNA-205,microRNA-21和micro RNA-27b与VEGF-A,bFGF有正相关性,具有显著统计学意义(p<0.05)。生物信息学对上述miRNAs进行靶基因预测、GO富集和KEGG Pathway分析发现:(1)miRNA-27b预测到6191个靶基因,筛选出与成血管有关的靶基因169个;其中三个生物信息学网站交集的靶基因分别为AGGF1,EPAS1,BMPR2。(2)miRNA-21预测到5003个靶基因,筛选出与成血管有关的靶基因98个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因分别为BMPR2和JAG1。(3)miRNA-205预测到7367个靶基因,筛选出与成血管有关的靶基因169个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因分别为FOXF1和QKI。(4)miRNA-486预测到6040个靶基因,筛选出与成血管有关的靶基因118个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因为TIE1。将microRNA-486,microRNA-205,micro RNA-21和microRNA-27b进行KEGG信号通路分析后,发现Wnt信号通路、FoxO信号通路为上述micro RNAs共有。3.EPCs在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达:与对照组相比,qRT-PCR检测LRP5,AXIN,β-catenin,LEF1及成血管标志物VEGF-A在受到机械力刺激、成血管诱导、同时接受机械力刺激及成血管诱导时表达逐步增高,GSK-3β的表达具有相反趋势。Western Blot检测β-catenin及VEGF-A的蛋白表达亦增高。结论:1.EPCs体外培养具备增殖分化形成新生血管的能力,牵张成骨中可能存在EPCs参与的血管发生机制。2.miRNA-486,miRNA-21,miRNA-27b,miRNA-205在牵张成骨血管形成中可能扮演着重要相辅相成的角色,在调控EPCs血管发生的过程中起到了重要的作用。3.miRNA-486,miRNA-21,miRNA-27b,miRNA-205可能通过抑制靶基因,进一步调控Wnt信号通路,达到促进血管生成目的。