论文部分内容阅读
自上世纪90年代大白菜游离小孢子培养在我国获得成功以来,该技术在我国白菜育种及相关基础研究中发挥了重要的作用。但传统的培养体系操作繁琐,难于高效地开展小孢子规模化的培养,同时基因型制约白菜小孢子培养技术的广泛应用是多年来该技术有待探明的核心问题之一。本研究围绕白菜小孢子培养体系的优化、影响白菜小孢子胚胎发生能力的基因定位与分析,探讨小孢子胚胎发生的机制,并尝试建立白菜小孢子的转基因体系,为推动小孢子培养技术在白菜类作物研究中获得更为深度广度的应用奠定基础。通过本研究取得以下结果:1.初步建立了白菜小孢子规模化培养体系:在国内首次利用机器提取替代人工挤压收集小孢子,在一定程度上消除了人为干扰因素,并简化了实验操作;利用细胞破碎仪可在短时间同时提取多份样品,而不影响小孢子的活力和胚胎发生能力,并能有效提高工作效率,使集中进行大量材料的游离小孢子培养成为可能。2.利用一种新的群体类型——BC2DH群体对影响白菜小孢子胚胎发生能力的相关基因进行定位分析。基于该群体120个单株已构建的遗传连锁图信息,以及BC2DH单株具渐渗系的特点,本研究将遗传图谱信息与材料表型进行直观比对寻找差异的方法,是一种新的方法尝试;本研究首次将影响白菜小孢子胚胎发生能力的基因座位锁定在A03染色体的3个InDel标记区段,对目标区段的基因挖掘,筛选到11个候选基因在白菜易出胚小孢子诱导初期高度表达,而在难诱导材料几乎不表达或表达下调。这些差异表达基因与细胞胁迫应激、细胞骨架重排以及胚胎的发育分化密切相关。3.对白菜小孢子诱导初期24h的RNA-seq分析获得5020个差异表达的基因,功能聚类分析显示小孢子早期的热激诱导,首先引起大量与细胞壁、细胞膜系统调控相关基因的差异表达;比较材料与温度两个因素,材料间的基因差异表达比25℃常温与33℃胁迫激发的基因差异表达更显著。4.培养基添加乙酰化酶抑制剂TSA,无需高温也能有效诱导易出胚白菜小孢子的胚胎发生,小孢子在成胚途径上与传统热激表现一致。研究推测TSA使小孢子组蛋白乙酰化水平的提高,激发了基因的重编程;并推测热激胁迫的启动机制与TSA作用效果相同。通过Q-PCR检测胚胎发生标志基因在白菜小孢子诱导初期的表达量,结果显示BABY BOOM、FUS3、NAPIN等胚发育标志基因在小孢子启动初期24h几乎不表达,而在胚状体发育阶段可见基因的显著转录表达。5.初步建立了适合于白菜小孢子的基因枪法介导遗传转化体系。小孢子作为转化受体,将发挥其群体数量大,易收集、且具强的胚胎发生能力和植株再生潜力的优点,有可能是解决白菜类作物再生困难,提高转基因效率的有效手段。本论文的研究进一步优化了白菜小孢子培养技术;对小孢子胚胎发生能力的基因定位有了突破性进展;并拓宽了白菜小孢子的应用领域。