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本文主要用常规PCR技术鉴定了蜂花粉源的致病菌种类,用实时荧光定量PCR技术检测了水溶性壳聚糖溶液抑菌前后蜂花粉源菌群的变化,同时还对油菜蜂花粉源的菌株特别是蜜蜂球囊菌的水溶性壳聚糖抑菌浓度进行了研究。结果如下:(1)从油菜蜂花粉中分离得到真菌9株(F1-F9),细菌12株(B1-B12)。通过形态学鉴定,初步判定F1、F5为土曲霉菌株;F4为黑曲霉菌株;F2、F3、F6和F7为根霉菌株;F8为拟蜜蜂球囊菌菌株;F9为拟黄曲霉菌菌株;B1-B12大多数为拟芽孢杆菌菌株。(2)根据形态学初步鉴定的结果,本试验选择出6个菌种(芽孢杆菌、黄曲霉、土曲霉、根霉、黑曲霉和蜜蜂球囊菌),分别设计引物,进行常规PCR技术鉴定。所得PCR产物测序后经与NCBI比对表明:F1、F5为土曲霉;F4为黑曲霉;F2、F3、F6和F7为根霉;F8为蜜蜂球囊菌;F9为黄曲霉菌;B1-B12菌株中除B6和B8外,其他均为芽孢杆菌。(3)采用常规PCR技术和实时荧光定量PCR技术,分别检测不同浓度水溶性壳聚糖对蜂花粉源6种菌群的抑制情况。结果表明:以混合菌株提取的DNA为模板进行的常规PCR,其各自产物的电泳条带亮度并不能给出其各自受到抑制前后的DNA总量的变化。由荧光定量PCR技术得到的CT值表明:水溶性壳聚糖对6种菌均有一定的抑制作用;随着浓度增加,其抑制作用增强。(4)以不同浓度梯度的水溶性壳聚糖溶液,对蜂花粉源的真菌(菌株F1-F9)、细菌(菌株B1-B12)进行抑制试验。结果显示:水溶性壳聚糖溶液对真菌的抑制效果较好。真菌中各个菌株对壳聚糖的耐力有所不同,由弱到强依次为(以抑制率达到50%以上时的壳聚糖浓度排序):F7和F8(大于0.02g/mL时),F1和F3(大于0.04g/mL时),F4(大于0.06g/mL时);F2、F6和F9有一定耐力,F5有较强耐力。细菌中各个菌株对壳聚糖的敏感性大不相同,由强到弱分别为(以壳聚糖的最小抑菌浓度MIC排序):B4(0.003125g/mL),B2、B3、B5、B6、B10、B11和B12(0.00625g/mL),B8(0.0125g/mL),B1、B7和B9(0.025g/mL)。(5)选取对壳聚糖耐力最弱的蜜蜂球囊菌(蜜蜂白垩病的主要致病菌)进行进一步的抑制试验,结果显示:培养48h后,浓度为0.04g/mL以上的平板内不长菌落,其抑制率为100%,浓度为0.04g/mL以下的菌落比对照组生长缓慢。培养72h后,浓度为0.08g/mL以上的平板内不长菌落,其抑制率仍为100%。培养3d、5d和7d后,菌落生长抑制率均随着壳聚糖浓度的增加而增加;当浓度大于0.04g/ mL后,抑制率均达60%以上,但抑制率增幅变得缓慢;在浓度相同时,抑菌效果随抑菌时间延长而下降。