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目的:研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)联合用药对缺血性脑卒中的保护作用并探讨其发挥保护作用的可能机制。方法:采用体外培养原代皮层神经元缺糖缺氧再复糖复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型和体内小鼠短暂性大脑中动脉阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R)模型造模。使用NAD~+/NADH试剂盒检测细胞、大脑皮层NAD~+的含量。用荧光显微镜直接观察NAD~+对细胞形态的影响。MTT法、LDH检测指标选择细胞上适宜的NAD~+浓度和作用时间。通过缺血再灌24 h后小鼠脑梗死体积、神经行为学评分、脑水肿含量等指标选择动物模型上合适的NAD~+剂量和作用时间。运用DHE探针标记检测细胞、大脑皮层ROS的变化及rGSH、SOD、MDA、ATP、LD试剂盒检测细胞、大脑皮层氧化还原能力和能量代谢水平的变化。采用MTT法、DHE探针标记及rGSH、MDA、ATP试剂盒检测NADPH和NAD~+联合用药对OGD/R诱导的细胞损伤的影响。通过脑梗死体积指标观察NADPH和NAD~+在不同剂量、不同时间配比时对缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导的脑损伤程度的影响。通过缺血再灌28天后小鼠生存曲线、脑萎缩体积检测及平衡木、转子杆、Y迷宫等行为学测试的一系列指标,观察联合用药对小鼠脑缺血再灌注的长期影响。彗星实验检测细胞DNA损伤情况。Westernblot方法检测缺血复灌后指定时间给予不同药物对大脑皮层中氧化损伤、凋亡相关蛋白表达的影响。结果:NAD~+可以穿过细胞膜进入细胞,对细胞生存和形态没有影响,结果显示NAD~+对OGD/R诱导的细胞损伤的保护作用呈浓度和时间依赖性,据此我们选择在复糖复氧0 h加入15 mM的NAD~+作用于OGD/R模型。NAD~+可以透过血脑屏障进入脑内,结果显示NAD~+对I/R诱导的细胞损伤的保护作用有剂量和时间依赖性,50mg/kg的NAD~+仅在再灌2 h内能显著减少tMCAO/R模型小鼠脑梗死体积,降低脑含水量,改善行为学症状。在小鼠脑缺血再灌注的体内外模型中,给予NAD~+可显著抑制OGD/R或I/R诱导的细胞内ROS、MDA、LD水平的上升及rGSH、SOD、ATP水平的下降。在脑缺血再灌注的体外模型中,NADPH和NAD~+联合用药比NADPH或NAD~+单独用药更有效地抑制OGD/R诱导的细胞死亡和细胞内ROS、MDA水平的上升及GSH、ATP水平的下降。在脑缺血再灌注的体内模型中,NADPH(2.5 mg/kg或7.5 mg/kg)和NAD~+(50 mg/kg)联合用药比NADPH或NAD~+单独用药更有效地减少缺血小鼠脑梗死体积,且两者合用让NAD~+在再灌4 h仍可减少缺血小鼠脑梗死体积,但在再灌5 h后无明显作用。在小鼠脑缺血再灌注后进行长期观察,结果显示NADPH(7.5 mg/kg)和NAD~+(50 mg/kg)联合用药比NADPH或NAD~+单独用药更有效地提高缺血小鼠长期生存率、减少脑萎缩体积并促进神经功能恢复。在小鼠脑缺血再灌注的体内模型中,脂质体氧化、DNA损伤、凋亡等相关蛋白的变化在复灌后16 h达到峰值,给予NADPH或NAD~+后可明显抑制它们的改变,且两者联合用药可更显著地抑制大部分蛋白的表达改变情况。结论:外源性NAD~+对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,而NADPH与NAD~+联合用药有增效作用,NADPH可以延长NAD~+的治疗窗,NAD~+可以降低NADPH的使用量,其作用机制可能与改善细胞代谢应激,抑制多条细胞死亡途径有关。以上结果提示NADPH与NAD~+联合用药可能为缺血性脑卒中的临床治疗提供新思路。