论文部分内容阅读
间质性肺疾病/肺纤维化是严重危害人类健康的—组疾病,其发病率呈逐渐上升趋势。由于大部分病因不明,发病机制不十分清楚,目前尚无有效的治疗方案。虽然肺组织已有的纤维化病变难以消除,但肺纤维化是一个慢性、进行性的病理反应过程,探索肺纤维化发病的分子机制以延缓或阻断纤维化发展进程的策略,仍具有重要的实际意义,—直是国际肺科学界的关注热点。在纤维化的发展过程中,肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,起关键作用。肌成纤维细胞是一种在超微结构和功能上兼有成纤维细胞和平滑肌细胞两者特征的非典型的成纤维细胞,特征性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)。多种细胞因子具有促进这种转化的作用,其中转化生长因子-β(transforming growth factor, TGF-β)的作用是肯定的,TGF-β/Smad促进肌成纤维细胞转化构成了肺纤维化发病过程中一个较为明确的机制,实验证明其是肌成纤维细胞转化的主要通路,但不是唯一通路。有研究发现Rho-Rock信号通路调控肌成纤维细胞表型标志α-SMA的表达,但其具体机制尚不清楚。因此我们有理由假设,Rho-Rock和TGF-β/Smad信号转导通路共同参与了成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化,且可能存在转导通路间的交叉路径,因而在肺纤维化的发生、发展中发挥着重要作用。如果我们的假设能得到验证,不仅可以完善Rho-Rock系统,为Rho-Rock信号通路在肺纤维化中作用给予更客观的评价,而且可以进一步完善TGF-β/Smad信号转导通路。目的:明确在TGF-β1刺激下, Rho-Rock对肺成纤维细胞-肌成纤维细胞转化的影响;探讨Rho-Rock通路在肺纤维化中的作用,以及Rho-Rock与TGF-β/Smad信号转导通路在肺纤维化中的交叉路径,为防治肺纤维化提供新的理论依据。方法:体外培养人胚肺成纤维细胞,以TGF-β1刺激和在刺激的同时添加抑制剂Y-27632(Rho-Rock通路阻断剂)或Staurosporine(丝/苏氨酸激酶抑制剂为TGF-β/Smad通路阻断剂),采用流式细胞仪和免疫荧光法检测α-SMA的表达,流式细胞仪观察细胞周期分布,ELISA法测定细胞培养液ECM含量,PT-PCR法检测RhoA、RhoC、Rock1和Smad2 mRNA水平的变化。结果:(1)TGF-β1可显著促进肺成纤维细胞α-SMA的表达,表明向肌成纤维细胞转化增多;而用Y-27632或Staurosporine处理后,α-SMA阳性细胞数明显下降。(2)TGF-β1刺激下肺成纤维细胞G0/G1期细胞数下降,S期细胞数增多;而用Y-27632或Staurosporine处理后,G0/G1期细胞数增加,S期和G2/M期细胞数下降。(3)TGF-β1增加肺成纤维细胞培养液中Ⅰ型胶原、LN、FN蛋白的含量;而用Y-27632或Staurosporine处理后,Ⅰ型胶原、LN、FN蛋白含量均下降。(4)TGF-β1增加肺成纤维细胞RhoA、RhoC、Rock1、Smad2 mRNA的表达;而用Y-27632或Staurosporine处理后,RhoA、Rock1、Smad2 mRNA表达下降,此外Y-27632抑制RhoC mRNA的表达。结论:(1)Rho-Rock通路参与肺成纤维细胞—肌成纤维细胞转化过程,阻断该通路抑制成纤维细胞增殖、ECM的合成。(2)Rho-Rock信号通路与TGF-β/Smad信号通路之间存在交叉路径。