论文部分内容阅读
粟酒裂殖酵母（Schizo saccharomyces pombe）的核糖体蛋白RPL32的由两个同源基因:rpl32-1和rpl32-2共同编码。本实验室前期研究发现S.pombe核糖体蛋白RPL32-2具有潜在的转录激活功能。在进一步研究RPL32-2功能时，我们发现RPL32蛋白基因敲除突变体rpl32-1△菌株和rpl32-2△菌株在营养丰富的液体培养基中培养时会发生絮凝现象，并且证实这种絮凝现象是由细胞壁表面某种糖蛋白引起的。 为了找到这个引起细胞絮凝的细胞壁蛋白，我们通过qRT-PCR技术，分析了野生型裂殖酵母菌株与絮凝菌株rpl32-1△和rpl32-2△部分细胞壁表面蛋白的转录水平。结果发现，rpl32-1△和rpl32-2△菌株的细胞壁蛋白基因SPA C186.01，SPBC947.04，SPAC977.07c，fta5和gas1表达量上升，其邙SPAC186.01，SPAC977.07c有较大幅度的上升。我们猜想这其中的某个或几个基因编码的蛋白是引起细胞絮凝的表面黏附因子。接着，我们构建了SPAC186.01，SPBC359.04c，SPAC977.07c，fta5，gas1等5个基因的过表达菌株，结果发现5个过表达菌株中都没有絮凝产生。同时，分别敲除絮凝菌株rpl32-1△基因组上的SPA C186.01，SPAC977.07c，gas1基因后，我们发现细胞的絮凝现象并没有消除。由此，我们推测由核糖体基因敲除而引发细胞絮凝可能并不是由单个基因引起的，而是多个基因相互作用的结果，而这些基因的高表达只是产生絮凝一个必要条件。并且细胞絮凝现象是由多个细胞表面絮凝蛋白共同引起的，这些蛋白在结构和功能上有很大的相似性，当我们敲除其中的一个后，其它絮凝因子可以替代其功能，因此絮凝现象并没有消除。 为了验证核糖体蛋白表达不足引起细胞絮凝这一现象是否为S.pombe所特有的，我们选取了S.cerevisiae作为材料，来验证这一现象是否具有普遍性。首先我们敲除了S.cerevisiae核糖体蛋白编码基因rpl15A和rps26B，结果S.Cerevisiae并没有像S.pombe一样产生絮凝现象。接着，我们利用基因定点突变技术构建了S.cerevisiae絮凝菌株，通过荧光定量PCR分析其部分核糖体蛋白基因的表达情况，发现絮凝菌株的核糖体蛋白基因表达量并没有下降。另外，我们分析了S.cerevisiae在有性絮凝时核糖体蛋白基因的表达量，发现其表达量也没有下降，相反部分核糖体蛋白基因表达量还有所上升。综合这些研究结果，我们不难看出，S.cerevisiae中并不存在像粟酒裂殖酵母中核糖体蛋白表达量不足而引起细胞絮凝的现象，这说明这一现象是S.pombe所特有的。 本实验室前期的研究发现RPL32-2具有潜在的转录调控作用，而RPL32-1则没有。为了进一步研究RPL32-1和RPL32-2的功能，我们分别构建了过表达RPL32-1和RPL32-2的菌株，结果发现，过表达RPL32-1菌株在EMM培养基中生长速度比野生型慢，到稳定期后有少量异形细胞出现，流式细胞分析发现过表达RPL32-1菌株中有大量1C细胞，并且有较强的热抗性。这些现象说明RPL32-1和RPL32-2在功能上存在差异性，最终通过Co-IP技术，我们筛选到一个可能特异结合RPL32-1的蛋白Grs1(mitochondrial and cytoplasmicglycine-tRNA ligase)。为了进一步确认Grs1与RPL32-1和RPL32-2之间是否存在相互作用，我们通过酵母双杂交来进一步分析。结果显示Grs1与RPL32-1和RPL32-2之间是都不存在相互作用。由于酵母双杂交存在局限性（如有时会产生假阴性结果，只能检测蛋白间直接的相互作用等），因此我们还需要通过其它的方法来进一步来验证。本研究证明核糖体蛋白RPL32-1和RPL32-2之间存在功能上的差异，它们能与不同的靶蛋白结合，行使某些特定的功能。这些结果对我们进一步研究RPL32-1和RPL32-2的功能具有重要意义。