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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种可长期定植于人类胃粘膜的革兰氏阴性螺旋形微需氧菌，在全世界范围内感染率超过50％。H.pylori是引起慢性胃炎和胃十二指肠溃疡的致病因子，流行病学和动物实验证实H.pylori慢性感染是导致胃癌的重要危险因素。H.pylori作为致病因子的特点虽已得到公认，但有关其致病的分子机制及感染结局多样性的本质仍未阐明。细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A，CagA)是H.pylori重要的毒力因子之一，可经cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统注入宿主细胞，通过依赖和或独立于磷酸化的机制，与宿主细胞涉及调控细胞生长和运动的多种蛋白相互作用，导致细胞功能异常。流行病学研究发现，CagA阳性H.pylori菌株感染比CagA阴性菌株更易增加十二指肠溃疡和胃癌等严重胃肠疾病发生的危险性，提示CagA蛋白可能与H.pylori的致病作用有关。分析H.pylori感染引起极化的单层上皮细胞基因水平的表达变化发现，超过90％的受影响基因依赖于cag致病岛的作用，而在依赖于cag致病岛的基因中有79％与CagA有关。因此，CagA可能是一种特殊的疾病相关蛋白，在H.pylori致病过程中发挥重要作用，进一步研究CagA蛋白的生物学功能及其参与H.pylori致病的机制，对于揭示H.pylori复杂的致病效应的本质及阐明其致癌的分子机制具有重要意义。本研究从不同侧面就CagA的生物学功能及其致病的分子机制进行探讨：首先，以临床分离株MEL-Hp27为研究对象，克隆全长cagA基因，并对其进行分子特征分析；然后，参考cagA基因全长序列，构建cagA基因敲除突变株(Hp27△cagA)，通过比较遗传背景相同的野生株与突变株生物学特性差异及其对宿主细胞增殖和凋亡的影响，初步评价与cagA基因相关的生物学作用及其在细胞水平的毒性效应；最后，利用蛋白质组学方法比较野生株与突变株的菌体总蛋白表达谱差异，以及野生株与突变株攻击胃粘膜上皮细胞Ges-1而引起的细胞总蛋白表达谱差异，筛选并鉴定与cagA基因有关的功能蛋白，为揭示CagA参与H.pylori致病过程的分子机制，探索其与胃癌的相关性提供实验依据。实验方法1 H.pylori的培养及基因组DNA的制备将H.pylori国际参考株NCTC11637和本室临床分离株MEL-Hp27(Hp27)分别接种于布氏平板上，37℃微需氧条件下培养。3天后收获H.pylori，抽提基因组DNA。2 Hp27 cagA基因克隆2．1引物设计及PCR扩增参考H.pylori 26695基因组序列，分别针对cagA基因编码区保守序列和位于cagA基因上、下游的结构基因序列设计两对PCR引物，交叉分段扩增包括cagA基因编码区、5′、3′非编码区在内的Hp27全长cagA基因序列。2．2 cagA基因分子特征分析将测序获得的cagA基因全长序列，登录GenBank数据库，对分离自不同地区的cagA基因编码序列进行系统发生树分析；并且比较cagA基因5′、3′非编码区序列特征；在东亚地区分离株中选择临床背景清楚的菌株对其CagA分子氨基酸序列进行系统发生树分析。3 cagA基因打靶载体的构建3．1参考Hp27cagA基因测序结果，PCR扩增cagA基因编码区两侧翼序列，作为同源臂片段，并从pEGFP-N2质粒上扩增卡那霉素抗性基因完整编码区(km~R)作为筛选标记。3．2将km~R连接于两同源臂片段之间，共同插人到pBluescript SKⅡ(-)载体的多克隆位点中，构建出带卡那霉素抗性标志的打靶载体pBSK-cagA-mutant。4 cagA基因敲除突变株的构建与鉴定采用电穿孔法将打靶载体pBSK-cagA-mutant转化入受体菌株Hp27中，在普通布氏平板上培养48h，而后转涂于含卡那霉素(25μg／ml)的布氏平板上继续培养3～6天，筛选出cagA基因敲除突变株(Hp27△cagA)，并经PCR及测序验证。5 cagA基因敲除突变株Hp27△cagA的生物学特性分析5．1应用尿素酶试剂，检测cagA基因敲除突变株Hp27△cagA与野生株Hp27的尿素酶活性差异，以国际参考株NCTC11637为阳性对照。5．2采用0.3％半固体琼脂穿刺法比较突变株与野生株的移行能力差别。5．3以细胞与细菌粘附实验来评价突变株与野生株的粘附作用差异。5．4突变株和野生株攻击Hela细胞，国际参考株NCTC11637为阳性对照，镜下观察细胞空泡样变，并结合中性红摄入法定量检测各组空泡毒素活性。6 cagA基因敲除突变株Hp27△cagA在细胞水平的毒性效应6．1野生株、突变株分别与BGC823细胞共培养，在6h、12h、24h和48h观察细胞形态学变化。6．2采用四唑蓝(MTT)比色法检测野生株与突变株对BGC823细胞增殖活性的影响。6．3流式细胞仪检测野生株、突变株与BGC823细胞共培养48h的细胞凋亡情况。7蛋白质组学方法7．1样品制备及浓度测定收获H.pylori野生株与cagA基因敲除突变株，采用超声兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取野生株与突变株菌体总蛋白备用；分别将含有野生株与突变株的细菌悬液加入细胞培养瓶中，与胃粘膜上皮细胞Ges-1共培养，野生株组和突变株组细菌与细胞的比例均为100：1，10h后收集Ges-1细胞，并采用超声兼Urea-CHAPS-DTT裂解法提取细胞总蛋白备用；Bradford法对细菌和细胞总蛋白进行定量。7．2双向电泳、图像分析、MALDI-TOF质谱分析和蛋白质鉴定应用等电聚焦(IEF)电泳和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)技术将野生株与突变株菌体总蛋白，及野生株与突变株分别攻击的Ges-1细胞总蛋白分离，得到蛋白的双向电泳图谱；用GS-800图像扫描仪获得凝胶图像，经PDQuest软件分析筛选差异表达的蛋白质点；从制备型凝胶上挖下蛋白质点，胶内酶解后，经基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获得蛋白质点的肽质量指纹图谱(PMF)，搜寻蛋白质数据库并联合生物信息学，鉴定蛋白质及分析其生物学功能。7．3质量控制差异蛋白质点的选择与确定，是利用标准化后蛋白质点的体积进行比较分析，对具有统计学意义的蛋白质点才作为进一步研究的对象。为保证双向电泳的重复性，对每个样品的蛋白质电泳图至少重复三次。8统计学分析应用统计软件SPSS11.0分析所有数据，计量资料以均数±标准差((?)±s)表示，两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较根据资料特点相应采用单因素方差分析或重复测量的方差分析。检验水准取a=0.05。结果1 H.pylori Hp27 cagA全长基因克隆及其分子特征分析成功克隆本室临床分离株MEL-Hp27的cagA全长基因，并登录GenBank数据库(登录号：DQ306710)，cag基因编码区长3510bp，编码1169个氨基酸，5′端非编码区长649bp，—10区、—35区分别位于起始密码子ATG上游89bp和154bp处。对cagA基因编码区序列进行系统发生树分析显示，东、西方菌株的cagA基因序列在系统进化上存在明显的地区差异。分析cagA基因非编码序列发现，Hp27 cagA基因非编码区特点与多数东亚分离株相似，但与西方分离株相比在调控序列长度、—10区、—35区位置等方面有一定差别，提示cagA基因非编码序列也存在地区差异性。对分离自东亚地区的临床背景清楚的CagA分子氨基酸序列进行系统发生树分析，结果发现CagA分子氨基酸序列可以聚为两群，一群中仅包含慢性胃炎、十二指肠溃疡分离株；另一群中包括胃癌分离株及慢性胃炎、十二指肠溃疡分离株，本室分离株Hp27在该群内。2 cagA基因敲除突变株(Hp27△cagA)的构建PCR法扩增得到用于同源重组的同源臂片段F1(710bp)和F2(970bp)，以及卡那霉素抗性基因(800bp)；将卡那霉素抗性基因连接于两同源臂片段之间，并与pBluescript SKⅡ(-)载体体外连接，构建出带卡那霉素抗性标志的打靶载体pBSK-cagA-mutant；采用电穿孔技术将打靶载体转化进入野生株Hp27菌体内，在含卡那霉素(25μg／ml)的布氏平板上筛选出cagA基因缺失的突变株Hp27△cagA。选用3对特异性引物，对突变株的基因组DNA进行鉴定，并以野生株为对照：野生株可以扩出cagA基因片段，而不能扩出卡那霉素抗性基因；突变株未能扩出cagA基因片段，但可扩出卡那霉素抗性基因；用cagA基因两侧的引物进行长片段扩增，野生株可以扩出包含完整cagA基因和非编码序列的长约5100bp的DNA片段，而突变株仅能得到约2500bp的DNA片段。测序结果与PCR鉴定结果一致：cagA基因已经缺失，cagA基因完整编码区(3510bp)被卡那霉素抗性基因(800 bp)所取代，该序列已登录Genbank数据库(登录号：DQ789393)。3 cagA基因敲除突变株Hp27△cagA的生物学特性分析尿素酶活性检测发现，国际参考株NCTC11637和野生株Hp27组在细菌与尿素酶试剂作用后，即刻会引起明显的颜色变化，而突变株组颜色改变非常缓慢。野生株组在20min即分解完全尿素酶试剂达到最大吸光度值，而突变株组在100min后才产生与野生株组相同的颜色变化，并且野生株在5～80min 9个时点的吸光度值均高于突变株组(p＜0.05)，提示两菌株间尿素酶活性可能存在差别，突变株尿素酶活性下降。H.pylori移行能力比较显示，在0.3％半固体布氏平板上培养5天后，H.pylori野生株从穿刺位点处向周围区域扩散开来(平均直径9.1±1.2mm)；而突变株只能形成面积较小的菌落集群(平均直径2.8±0.7mm)，二者差异有统计学意义(p＜0.01)，提示cagA基因缺失使H.pylori移行能力下降。另外，突变株与野生株在对细胞的粘附作用及其空泡毒素活性方面没有明显差别。4 cagA基因敲除突变株Hp27△cagA对胃癌细胞株BGC823细胞增殖和凋亡的影响在野生株攻击BGC823细胞6h即可引起细胞的形态学变化，48h时可观察到细胞形态呈分散及蜂鸟样改变(细胞拉伸)，突变株组细胞也出现与野生株组类似的细胞形态学变化。MTT试验显示，在H.pylori与细胞共培养的20h、25h和30h各组细胞增值活性差异均有统计学意义(p＜0.05)，两两比较发现，野生株组细胞增值活性低于对照组和突变株组(p＜0.05)，而突变株组与对照组之间差别无显著性。流式细胞分析显示，在攻击BGC823细胞48h，野生株和突变株均可引起细胞凋亡，凋亡率分别为8.4％和9.1％，均高于对照组凋亡率2.7％(p＜0.05)，但两实验组差别无统计学意义。5 H.pylori野生株与cagA基因敲除突变株蛋白质组差异表达的研究分析H.pylori野生株与cagA基因敲除突变株菌体蛋白的2-DE凝胶图谱发现，共有22个差异表达的蛋白质点，与野生株相比，突变株菌体总蛋白中4个蛋白质点表达上调，8个蛋白质点表达降低，10个蛋白质点缺失表达。选取在野生株菌体总蛋白中呈高表达而在突变株中不表达或低表达的5个蛋白点进行质谱分析与鉴定，共鉴定出烷基过氧化氢物还原酶(Alkyl hydroperoxide reductase，Ahp)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，Sod)和药物活性调控因子(Modulator of drug activity，Mda66)等3种蛋白。分析这些蛋白的生物学功能发现，3种蛋白均是H.pylori重要的抗氧化应激蛋白。6 H.pylori野生株与cagA基因敲除突变株对胃粘膜上皮细胞Ges-1作用的蛋白质组学研究比较分别经H.pylori野生株和cagA基因敲除突变株攻击的胃粘膜上皮细胞Ges-1细胞总蛋白的2-DE凝胶图谱发现，共有20个差异表达的蛋白质点，与野生株组相比，突变株组细胞总蛋白中1个蛋白质点表达上调，11个蛋白质点表达降低，8个蛋白质点缺失表达。选取在野生株组细胞总蛋白中呈高表达而在突变株组不表达或低表达的5个蛋白点进行质谱分析与鉴定，共鉴定出两类蛋白：一类是抗炎蛋白：膜联蛋白A1(Annexin A1)和血小板激活因子乙酰水解酶IB亚单位γ(Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit gamma)；另一类是肿瘤相关蛋白：膜联蛋白A1(Annexin A1)、磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase)和α-烯醇酶(α-Enolase)。该研究结果为证实CagA与H.pylori的致炎作用有关，及揭示CagA参与H.pylori的致癌机制提供了直接证据。结论1、克隆幽门螺杆菌MEL-Hp27全长cagA基因，发现除cagA基因编码区序列外，cagA基因调控序列也存在东、西方地区性差异；系统发生树分析发现，东亚分离菌株可以按CagA分子氨基酸序列特征分为包含胃癌分离株和不包含胃癌分离株的两个菌株群。2、以源自中国的临床分离株为基础，构建cagA基因敲除突变株，为研究幽门螺杆菌中国株cagA基因的功能奠定实验基础。3、首次发现cagA基因敲除会抑制H.pylori的尿素酶活性，并会造成H.pylori的移行能力下降，该作用可能是cagA基因参与H.pylori致病过程的机制之一。4、cagA基因可能是H.pylori抑制宿主细胞增值所必需的成分，该基因的敲除使H.pylori对细胞增值的抑制作用消失。5、首次发现cagA基因与H.pylori的抗氧化应激蛋白(烷基过氧化氢物还原酶、超氧化物歧化酶和药物活性调控因子)的表达有关，cagA基因可能直接或间接的影响H.pylori抗氧化应激蛋白的表达，从而对于维持H.pylori正常的抗氧化应激能力进而确保其在宿主胃内持续定植非常重要，这可能是CagA参与H.pylori致病的机制之一。6、首次在H.pylori作用的胃粘膜上皮细胞总蛋白表达谱中，发现与cagA基因相关的两类蛋白：一类是抗炎蛋白(膜联蛋白A1、血小板激活因子乙酰水解酶IB亚单位γ)，另一类是肿瘤相关蛋白(膜联蛋白A1、磷酸丙糖异构酶和α-烯醇酶)。本研究结果为证实CagA与H.pylori的致炎作用有关，及揭示CagA参与H.pylori的致癌机制提供了直接证据。