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矮牵牛（Petunia hybrida）素有“花坛植物之王”的美誉。目前矮牵牛花色品种丰富，但由于花色素代谢特征和基因资源限制，黄色花及橙色花品种极为少见；小花矮牵牛（Calibrachoa hybrida）与矮牵牛为同科不同属的植物，近几年广为栽培，具有各种鲜亮的黄色、橙色品种，可以为黄色矮牵牛品种培育提供基因资源，但两者亲缘关系相对较远，存在明显的有性杂交障碍，难以获得远缘杂交后代。植物体细胞融合技术可克服远缘杂交亲和性差的困难，为培育黄色矮牵牛种质资源提供一条可行途径。本实验以矮牵牛锦浪系列(Petunia hybrida?Shock Wave‘)白色花品种和小花矮牵牛（Calibrachoa hybrid?lindurayellow‘）黄色花品种为材料，探索影响叶肉原生质体分离及培养的诸多因素，建立适合该品种矮牵牛和小花矮牵牛的原生质体分离以及培养体系，为矮牵牛和小花矮牵牛通过体细胞融合培育矮牵牛新品种奠定基础。 1.矮牵牛原生质体分离培养及再生 （1）原生质体分离体系的建立 以顶芽下第3-5节上完全伸展的幼嫩叶片为材料，通过对甘露醇浓度、水解酶种类及浓度、酶解时间、离心加速度等因素的比较得到适宜分离条件为，酶解液由2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.4%离析酶+0.5 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2组成，静置酶解5 h，1100 rpm离心2 min，升降加速度为0。原生质体产量及活性可分别达到2.90×106个·g-1和88.1%。 （2）原生质体培养及再生 通过对培养方法、激素浓度及原生质体培养密度等因素的比较得到，适宜的培养条件为，纯化后的原生质体在KM8P+0.5 mg/l6-BA+2.0 mg/l NAA培养基中固液培养，培养密度为0.5×105个/ml，黑暗环境24℃恒温培养。培养17 d后形成肉眼可见的乳黄色微愈伤组织，培养30 d后，将微愈伤组织转移至增殖培养基，培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+0.5 mg/l6-BA+0.5 mg/l NAA，培养温度(24±1)℃，光照14h·d-1，光照强度3000 lux，20 d后微愈伤组织长至5 mm，转移至分化培养基中: （1）培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+0.5 mg/l6-BA+0.1 mg/l NAA，第13 d分化出根； （2）培养基成分为MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+1.0 mg/l ZT+0.1 mg/l NAA，第16 d分化出芽。 2．小花矮牵牛原生质体分离及培养 （1）原生质体分离体系的建立 以幼嫩叶片为材料，通过对甘露醇浓度、水解酶种类及浓度、酶解时间、预处理方式等因素的比较得到，适宜分离条件为，4℃黑暗预处理叶片24 h，酶液成分为2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8%离析酶+0.25 M甘露醇+20 mM MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，静置酶解5 h，1200 rpm离心2 min，升降加速度为0。原生质体产量及活性可分别达到5.60×106个·g-1和87%。 （2）原生质体培养体系的建立 通过对原生质体培养方法、激素浓度及培养密度等因素的比较得到，适宜的培养条件为，纯化后的原生质体在KM8P+0.5 mg/l6-BA+0.5 mg/l NAA培养基中固体培养，培养密度为0.5~1.0×105个/ml，黑暗环境24℃恒温培养。培养第3 d原生质体再生细胞壁，第4-5 d开始第一次分裂，分裂频率为0.6%，21 d后可肉眼观察到培养皿中白色的微愈伤组织。