论文部分内容阅读
研究背景与目的：肺癌是世界上许多国家和地区发病率和死亡率很高的恶性肿瘤，发病率逐年上升，是全球头号癌症杀手，已成为严重的公共健康问题。肺癌的治疗方法主要以化疗、放疗和手术切除为主，但由于化学药物的严重毒副作用和耐药性明显降低患者长期生存率。因此，寻找更理想的治疗方法，延长患者无病生存期，提高长期生存率，改善生存质量，已成为目前医学研究的重要任务之一。进一步明确恶性肿瘤发生与发展的分子生物学机制和基因遗传机制，具有重要意义。小干扰RNA（siRNA）技术是通过双链RNA技术降解靶基因，抑制癌基因的表达，从而抑制恶性肿瘤的发生发展。在受到某些生物、理化等因素作用下，原癌基因可通过突变、重组等发生结构或表达水平的异常，则可成为癌基因，导致肿瘤的发生。明确原癌基因在肺癌发生发展中的作用，并沉默原癌基因，从而达到抑制肺癌细胞生长与增殖，将是未来肺癌治疗的主要研究方向。目前应用慢病毒介导的双链RNA（shRNA）技术已成功诱导基因靶向抑制作用，并广泛应用在恶性肿瘤的治疗中。构成型光形态建成同源亚基3（COPS3）是COP9信号转导体第3个亚单位，具有高度保守性，通过泛素蛋白酶体通路，降解p53原癌基因，因此COPS3与肿瘤发生发展的关系密切。p53基因突变会导致p53蛋白失活，而COPS3基因过表达也同样导致p53蛋白降解失活，可见COPS3与p53蛋白失活之间有密切联系。骨肉瘤中COPS3蛋白表达增高，来源于高度转移性骨肉瘤的细胞系也表达高水平COPS3蛋白。通过siRNA技术抑制COPS3基因表达，可以抑制高度转移性骨肉瘤细胞系的细胞增殖与转移。这些结果提示，COPS3基因与骨肉瘤的发生发展有关，可能是骨肉瘤的原癌基因，可通过基因靶向作用抑制其表达，从而抑制骨肉瘤细胞生长及增殖，阻止骨肉瘤细胞转移。目前，COPS3基因的这些生物学功能已在骨肉瘤细胞中被发现，然而，这些功能在其他恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞系中是否存在，目前仍缺乏深入研究。COPS3基因在肺癌细胞中的生物学作用，尚未见研究报道。本研究的主要研究内容和目的有四个：第一，明确COPS3基因在肺癌细胞系中的表达与功能。本研究选取两株肺癌细胞系，通过siRNA技术干扰COPS3基因表达，进一步观察细胞生长、增殖情况；第二，通过检测细胞周期及凋亡，初步探讨COPS3基因沉默能否影响肺癌细胞的生长及增殖；第三，通过siRNA技术敲低肺癌细胞系COPS3基因后，观察这些肺癌细胞系移植裸小鼠体内后的成瘤情况，进一步明确COPS3与肿瘤发生、发展的关系；第四，通过siRNA技术成功干扰COPS3基因表达后，应用Western blot技术检测下游靶基因p21、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、CDK4、细胞周期蛋白B1（cyclinB1）、cyclin D1等的表达情况，进一步明确COPS3蛋白与下游靶基因表达的关系，明确肺癌发生发展中新的原癌基因和新的发病机制，为肺癌治疗提供理想靶点和方法。研究方法：1.应用siRNA技术干扰COPS3基因表达，采用倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，Realtime PCR和Western blot法检测肺癌细胞系A549和95D细胞COPS3的敲减效率。2.采用MTT法、BrdU法和细胞克隆形成试验，检测沉默COPS3基因后，肺癌A549及95D细胞的增殖情况。3.应用流式细胞术检测COPS3基因敲低后细胞周期的改变情况。4.应用Annexin V/PI双染流式细胞术，检测COPS3基因敲低后肺癌细胞的凋亡。5.应用裸小鼠进行体内研究，检测COPS3基因敲低后的肺癌细胞移植裸小鼠体内的成瘤体积、重量及成瘤速率。6. Western blot技术检测COPS3基因敲低后下游靶基因p21、CDK2、CDK4、cyclinB1和cyclinD1等的表达水平。研究结果：1.应用慢病毒介导RNAi技术干扰A549和95D细胞COPS3表达，3天后90%细胞内可见绿色荧光蛋白存在，Realtime PCR和Western blot检测显示，感染si-COPS3后5天的A549和95D细胞中COPS3mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。2. MTT检测结果显示，COPS3基因沉默后A549和95D细胞在第5天增殖活力显著降低，细胞增长缓慢（P<0.01）；BrdU检测结果显示，COPS3基因沉默后A549和95D细胞DNA合成活力均显著降低，细胞增殖率显著下降（P<0.01）；克隆形成试验计数结果表明，COPS3基因敲低的A549和95D细胞克隆形成数显著低于对照组（P<0.01），95D细胞敲低COPS3基因后无克隆形成。3. si-COPS3慢病毒感染后，处于G0/G1期的细胞显著增加，处于S期和G2/M期的细胞显著减少（P<0.01），A549细胞发生凋亡显著增加（P<0.05）。4. COPS3基因敲低后的肺癌细胞移植裸小鼠体内，其成瘤体积及重量均低于对照组，成瘤生长曲线显示裸小鼠成瘤速度明显下降（P<0.05）。5.通过小干涉RNA技术定向敲低COPS3基因表达，其下游靶基因p21表达上调，CDK4与cyclinB1表达下调，而CDK2与cyclin D1表达水平无改变。结论：1.在A549和95D肺癌细胞系中均有COPS3基因表达，应用慢病毒介导基因敲低技术成功降低肺癌细胞系A549和95D细胞COPS3表达。2.在肺癌A549和95D细胞中，下调COPS3基因表达可使肺癌细胞增殖受到抑制，克隆形成明显减少，恶性程度显著降低。3.敲低COPS3后肺癌细胞周期阻滞于G0/G1期，增殖能力明显受到抑制。4.敲低COPS3基因后A549细胞凋亡明显增加。5. COPS3基因敲低的肺癌细胞移植裸小鼠体内后，可抑制裸小鼠体内肿瘤的生长。6.下调肺癌细胞系中COPS3蛋白表达，可上调p21蛋白表达，下调CDK4和cyclinB1蛋白表达，使p21与cyclinB1/CDK4形成复合物，抑制DNA合成，使细胞周期停滞在G1期，抑制肿瘤生长。这些研究结果表明，COPS3基因表达与肺癌的发生与发展密切相关，可能是诱导肿瘤发生与发展的原癌基因，本研究结果为肺癌的发病机制和治疗靶点提供了新的依据。