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媒介传染病占全部传染病的17%以上。蚊作为重要的传播媒介,可传播疟疾、登革热、西尼罗热等多种蚊媒病。控制蚊媒是蚊媒病综合防治策略的主要手段,其中化学防治具有高效、长效、低毒、使用方便等优点,在控制蚊媒中占有重要地位。杀虫剂长期、大量的使用,蚊媒随之产生的杀虫剂抗性已成为蚊媒病防治的最大障碍。如何科学合理地治理抗药性已成为亟待解决的问题。深入了解抗药性机制,可为制定抗药性治理策略提供基础。代谢抗性在抗药性机制中的研究最为广泛,代谢酶中的细胞色素P450与杀虫剂抗性的关系最为密切。现有关P450的调控研究主要集中在转录前,转录后的调控研究甚少。microRNA(miRNA)作为转录后的调控因子参与多种生命活动的调节,目前miRNA在昆虫中的研究主要集中在昆虫对病原体感染免疫方面,miRNA尤其是miRNA簇与蚊抗药性的关系未见报道。本实验室前期以淡色库蚊为研究对象,采用高通量测序法获得了溴氰菊酯敏感(DS-strain)和抗性品系(DR-strain)间差异表达的miRNAs。其中,miR-71在溴氰菊酯敏感品系中高表达,并可通过调控CYP325BG3的表达参与蚊抗药性。对miRNA的测序结果分析,发现当miRNA基因间排列的最大距离(MID)为10 kb时,miR-71与miR-2和miR-13成簇排列形成miRNA簇。本研究旨在探讨miRNA簇在蚊抗药性中的作用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),对miR-2～13～71簇在DS-strain品系和DR-strain品系间表达量进行检测。结果表明,miR-2和miR-13在DS-strain品系中较DR-strain品系中分别高表达2.32倍、1.86倍(P<0.05),与miR～71的表达趋势一致。在DS-strain品系中注射miR-2或miR-13或miR-71的inhibitor后,经美国CDC接触瓶检测蚊对溴氰菊酯敏感性的变化。结果显示,在DS-strain品系中抑制miR-2或miR-13或miR-71后,蚊对溴氰菊酯敏感性降低,死亡率降低;在DR-strain品系蚊中注射相应的miRNA mimic后,蚊对溴氰菊酯的敏感性升高,死亡率升高。结果提示,miR-2～13～71簇与蚊抗药性相关。对miR-2和miR-13进行靶基因预测,两者的种子域能与CYP9J35的3’端非编码区(3’UTR)互补配对。经qRT-PCR验证,CYP9J35的表达量在DR-strain品系中较DS-strain品系高表达3.78倍(P<0.05)。双荧光报告系统检测的结果显示,在与miR-2或miR-13 mimic共转染组中,可使CYP99J35的荧光素酶的荧光读值减弱38%或31%(P<0.05)。在蚊体内高表达miR-2或miR-13后,CYP9J35的表达量降低33%或40%(P<0.05);而抑制miR-2或miR-13后,CYP9J35的表达量升高2.00倍或1.80倍(P<0.05)。以上结果提示,miR-2和miR-13可以调控CYP9J35的表达。在DR-strain品系中敲低CYP9J35的表达后,CDC接触瓶检测发现可使蚊对溴氰菊酯的敏感性增加,死亡率升高。结果提示,CYP9J35是一个与抗药性相关的新的P450基因。在DR-strain品系中高表达miR-71后,miR-2和miR-13的表达量受到抑制,分别降低了 43%和49%;在DS-strain品系中抑制miR-71的表达后,miR-2和miR-13的表达量分别升高2.01倍和2.49倍(P<0.05)。反之亦然。结果提示,miR-2～13～71簇内可能存在内平衡调节机制,以维持整个簇的功能稳定。当高表达miR-71后,检测靶基因CYP325BG3的表达量降低,而miR-2和miR-13调控的靶基因CYP9J35的表达升高了 4.10倍(P<0.05);当miR-2和miR-13的表达增加时,靶基因CYP9J35表达降低,CYP325BG3表达升高了 2.50倍(P<0.05)。靶基因的表达变化进一步说明,miR-2～13～71簇内可能存在内平衡调节机制,与靶基因CYP325BG3和CYP9J35存在网络调控。以DS-strain和DR-strain品系的cDNA为模板分别扩增CYP9J35的ORF序列,获得的ORF长度为1506 bp,共编码501个氨基酸(GenBank登录号:KY780946,2017)。对比DS-strain和DR-strain品系中获得的ORF序列,发现两者存在3个位点同时出现的同义突变:933T>A、939G>A和945T>C,突变频率在DR-strain品系中为70%,在DS-strain品系中为26%;在1143位点存在2种突变型,在DS-strain品系中为1143C>T的同义突变,而在DR-strain品系中则为1143C>A的非同义突变,导致第381个氨基酸从苯丙氨酸突变为亮氨酸(F381L)。此位点的氨基酸改变是否会改变酶的活性尚有待进一步研究。本研究首次报告了 miR-2～13～71簇与蚊抗药性相关,其通过调控靶基因CYP325BG3和CYP9J35的表达参与蚊抗药性,为蚊抗药性中代谢酶的转录后调控研究奠定了基础;CYP9J35 ORF存在4个位点突变和5种突变型,为抗药性进化研究提供了依据。