论文部分内容阅读
研究背景:心脏中的心肌细胞在病理状态下会发生肥厚性生长。心肌肥厚最初是一种适应性过程,可产生足够的力量来适应壁张力或工作量的增加,但持续心肌肥厚会发生失代偿,导致心力衰竭。心肌肥厚在细胞水平上的特征是心肌细胞肥大和蛋白质合成增加以及基因表达的胚胎化重编程。既往研究主要关注信号转导通路及基因转录水平对肥厚的调控作用。尽管在基因表达的转录水平已取得重大进展,但基因表达的转录后调控也是调控心肌重构的关键机制。RNA上N6-甲基腺苷(m6A)甲基化是最丰富的RNA转录后化学修饰,由甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)以及肾肿瘤相关蛋白(WTAP)等组成的复合物催化。RNA结合蛋白特异性识别RNAm6A甲基化修饰并结合RNA,通过调控RNA剪接,核输出,衰减,稳定性和翻译等来影响RNA命运,在多种生理过程中控制基因表达,发挥其生物学功能。但是,RNAm6A甲基化在心肌细胞和动物模型心脏功能中的功能是完全未知的。可变剪接(Alternative Splicing)是另一个重要的基因转录后调控机制,通过选择性地去除或保留外显子和/或内含子,从单个mRNA前体产生多个mRNA,从而增加转录组和蛋白质组多样性。目前我们对正常和病变心肌可变剪接图谱还缺乏了解,可变剪接在心肌疾病中的调控作用尚有待揭示。因此,本研究旨在阐述RNA m6A甲基化在心肌重构中的作用,以及绘制人心脏组织mRNA可变剪接图谱,探究心肌重构中可变剪接的变化情况。研究方法:为了研究RNA m6A甲基化在心肌重构中的调控作用,我们通过Western Blot检测肥厚型心肌病(HCM)患者心肌组织中RNA甲基转移酶复合物三个组分的表达情况,并检测RNA m6A甲基化的变化情况。利用Crispr/Cas9技术在小鼠WTAP基因第四外显子两侧插入Floxp序列构建WTAPFloxp/Floxp小鼠,与MYH6-creERT2小鼠杂交,以此构建受他莫昔芬诱导的心肌细胞特异性WTAP敲除小鼠模型。8周龄小鼠注射他莫昔芬(40mg/kg),分别在基线和压力负荷下记录生存状况,使用超声心动图测量EF值和FS值来评估心功能,取心肌组织检测RNA m6A甲基化、心肌肥厚标志物、心肌纤维化、心肌细胞截面积等。分离新生大鼠心肌细胞,分别通过小干扰RNA(40mM)和腺病毒(MOI=10)来敲低和过表达WTAP,并施加肥厚刺激(2%FBS),检测心肌细胞面积、RNA m6A甲基化以及肥厚标志物等。为了研究可变剪接在心肌重构中的调控作用,我们提取HCM患者和正常人心肌组织的RNA并进行链特异性RAN深度测序,检测可变剪接变化,并通过功能富集分析初步了解HCM中受可变剪接调控的信号通路。qPCR检测可变剪接导致的不同转录本的表达变化,并在小鼠肥厚心肌模型中验证。研究结果:我们通过Western Blot发现HCM患者心肌中WTAP、METTL3和METTL14的蛋白水平均显著下降,提示心肌肥厚中可能发生RNA m6A甲基化水平降低。我们测量了 HCM患者RNAm6A甲基化的水平,发现其显着降低。心肌特异诱导WTAP敲除小鼠的存活率显著低于对照组,EF值和FS值降低。在压力负荷下,心肌特异诱导WTAP敲除小鼠无法发生代偿性肥厚,且存活率显著低于其对照组,EF值和FS值降低,纤维化增加,心肌细胞横截面积变小。新生大鼠心肌细胞在敲低WTAP后肥厚标志物表达升高,在肥厚刺激下虽然肥厚标志物表达升高,但是细胞面积却没有变化;过表达WTAP后,心肌细胞面积变大,但是肥厚标志物表达降低。我们在人类心肌组织中共发现11604个基因的94990个可变剪接事件,其中124个基因的可变剪接在HCM心肌组织中发生显著改变;GO和KEGG通路富集分析,显示可变剪接主要影响肌丝滑动、心肌收缩、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、钙离子信号通路等功能或通路。RNA测序和qPCR均显示虽然CAMK2δ表达总量不变,但是它的两个外显子互斥转录本,CAMK2δ3和CAMK2δ9的表达量发生了相反的改变;小鼠肥厚心肌模型也验证了这一发现。结论:我们的研究发现WTAP介导的RNA m6A甲基化是心肌细胞代偿肥厚所必需的;RNA甲基化增加导致代偿性心肌肥厚,而RNA甲基化减少则导致心肌细胞功能障碍,表明维持RNA m6A修饰稳态对维持正常心脏结构和功能至关重要。本研究首次绘制了人类心脏可变剪接图谱,明确了 HCM中多个基因发生可变剪接改变;发现即使基因表达总量没有变化,但基因不同转录本却可能通过可变剪接发生显著改变。我们的研究提示可变剪接在HCM心肌肥厚中可能发挥重要作用,可变剪接图谱分析有助于更好的识别疾病相关的基因和通路。