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神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由于中枢或者外周神经病理性改变引起的顽固性疼痛,主要特征为自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperagesia)及痛觉超敏(allodynia)。临床上,虽然药物治疗NPP已取得了较好的疗效,但是由于NPP发病机制复杂,仍有部分病人疼痛控制效果不佳,长期大量使用药物控制NPP可能会出现药物的副作用或脏器功能的损害,并给患者带来沉重的经济负担。近年来基于神经调控的介入治疗被逐步应用到各种顽固性疼痛的治疗,并取得了理想的治愈效果。经颅直流电刺激(Transcranial Direct Current Stimulationt,t DCS)是一种安全、无创、非侵入式的神经调控新技术,利用微弱的直流电作用于颅骨表面特定的靶向区域,使大脑皮层发生可塑性的改变;已经被证实可有效缓解纤维背痛、术后疼痛、脊髓损伤后疼痛等难治性疼痛。t DCS的镇痛机制尚不明确,但是其镇痛效果受刺激电极的极性、大小、刺激电极埋置的靶向位置等客观因素的影响,同时也与患者的病程及刺激的干预次数等主观因素有关,研究还发现谷氨酸、γ-氨基丁酸等神经递质参与了t DCS对皮层的可塑性调控,抑制皮层NMDA受体可以削弱t DCS产生的后效应。P2X受体属于嘌呤能离子通道型受体,在慢性疼痛的伤害性信息传递中起重要作用。当机体受到伤害性刺激时,大量ATP从受损神经末梢释放,与细胞膜上的P2X受体结合,引起阳离子大量内流导致细胞去极化,同时P2X受体还通过与谷氨酸相互作用进一步激活疼痛通路,许多研究证实谷氨酸NMDA受体活化与痛觉中枢敏感化的产生和维持有关;在脊髓以上水平,尤其是在中枢NMDA受体和P2X3受体却发挥着完全相反的作用,激活NMDA受体和P2X3受体可以产生镇痛效果。中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)是机体疼痛调制系统的重要位置,在上行调控的过程中参与将脊髓和延髓的伤害性信息投射至更高级中枢,同时还发出纤维参与高位中枢对疼痛的下行调控,研究PAG脑区对疼痛信息的调控,有助于了解t DCS镇痛的机制。我们推测t DCS通过刺激大脑皮层,促进皮层神经元可塑性改变,进而投射至PAG并激活相关的下行抑制通路,产生镇痛作用;而NMDA受体和P2X3受体则参与了t DCS对皮层及PAG疼痛信息的加工。本课题拟采用坐骨神经缩窄性损伤模型(chronic constriction injury of sciatic nerve,CCI)为研究对象,建立t DCS刺激模型,通过改变不同的刺激参数筛选t DCS治疗病理性疼痛的最佳参数组合;在此基础上,运用形态学、电生理以及行为学技术,研究PAG脑区P2X/NMDA受体在神经病理性痛调控中的作用;通过在体行为学及离体电生理实验,研究P2X/NMDA受体参与t DCS镇痛的机制。该研究对阐明神经病理性疼痛机制、提高t DCS镇痛效率具有重要的意义。方法:1.建立SD大鼠神经病理性疼痛(CCI)模型,通过Von Frey纤维丝和热辐射法检测大鼠建模前后结扎侧后肢机械痛阈和热痛阈的变化;2.通过调整电极埋置位置(同侧/对侧)和电流极性(正极/负极)建立四种方式的t DCS治疗模型,分别检测单次和重复运用这四种刺激方式对CCI大鼠结扎侧后肢机械痛阈和热痛阈的变化,确定最佳的刺激方式;在此基础上,继续检测刺激强度、刺激时程以及介入时间点对CCI大鼠痛阈的变化,确定最佳的刺激参数组合;3.通过免疫组织化学染色和免疫印迹技术,观察经t DCS刺激后CCI大鼠初级运动皮层(primary motor cortex,M1)以及PAG脑区P2X3受体和NR2B受体表达分布以及蛋白水平变化;4.全细胞膜片钳技术观察记录正常大鼠PAG脑区神经元在分别给予P2X3受体特异性激动剂α,β-亚甲基ATP(α,β-methylene-ATP,α,β-me ATP)和特异性阻断剂A-317491后神经元兴奋性的变化,观察NMDA受体抑制剂MK-801对PAG神经元兴奋性变化的影响;观察记录CCI大鼠在分别给予A-317491和MK-801后神经元兴奋性的变化;5.制备vlPAG脑内置管后的CCI大鼠模型,注射A-317491阻断P2X3受体功能后,在PAG微量注射ATP的类似物α,β-me ATP,观察CCI大鼠机械痛阈和热痛阈的变化;注射MK-801阻断NMDA受体功能后,在PAG微量注射α,β-me ATP,观察CCI大鼠机械痛阈和热痛阈的变化;6.制备vlPAG脑内置管后的t DCS大鼠模型,t DCS治疗结束后分别注射A-317491和MK-801,观察CCI大鼠机械痛阈和热痛阈的变化,明确P2X3受体和NMDA受体对rDCS镇痛作用的影响。结果:1.成功制备CCI大鼠模型,该模型能够较好的模拟慢性神经病理性疼痛,观察发现CCI大鼠机械痛阈及热痛阈值较正常组大鼠降低,至术后14d达到最低值,其后痛阈值逐步恢复,痛行为逐步改善。2.成功制备tDCS刺激模型,这种模型可以根据需求设置为阳极t DCS和阴极t DCS。单次的阳极/阴极t DCS均可以引起CCI大鼠的机械痛阈及热痛阈升高,同侧阴极t DCS的镇痛效果要优于对侧阳极t DCS,但是各组镇痛效果在24h内逐步消失;重复的阳极/阴极t DCS能有效地改善CCI术后所导致的痛行为,但是改善的效果及治愈率取决于t DCS相关各项参数,刺激时间越长、刺激的强度越大,t DCS所产生的镇痛作用就越好,且这种镇痛作用的后效应可以维持一周以上;对侧阳极对CCI大鼠镇痛的效果最稳定。t DCS对痛阈的恢复还与介入时间相关,介入时间越早、介入的次数越多,CCI大鼠疼痛的恢复程度就越好。3.免疫组织化学和免疫印迹的结果显示CCI术后14d,M1以及中脑vlPAG脑区P2X3受体以及NR2B阳性分布和蛋白表达与正常大鼠相比均有增加;阳极/阴极t DCS刺激后均可以引起CCI大鼠vlPAG以及M1脑区的P2X3和NR2B受体阳性表达和蛋白表达进一步增加。CCI术后14d,M1以及vlPAG区域Glu R1受体表达增加,阳极/阴极t DCS刺激后这两个区域Glu R1受体的表达及蛋白总量有所减少。4.全细胞膜片钳记录显示α,β-me ATP可使正常大鼠PAG神经元兴奋性显著增强,应用A-317194以及MK-801,均可使神经元兴奋性显著降低。与正常大鼠相比较,CCI大鼠PAG神经元的兴奋性明显增强,应用A-317194和MK-801可抑制CCI大鼠PAG神经元的兴奋性。5.vlPAG脑区微量注射A-317194后CCI大鼠损伤同侧后肢的热痛阈和机械性痛阈均未发生明显变化;给予α,β-me ATP后CCI大鼠机械痛阈和热痛阈明显升高,且具有统计学差异,α,β-me ATP的镇痛效应具有剂量依赖性和时间依赖性;PAG微量注射A-317491预处理后,α,β-me ATP产生的镇痛效果被显著削弱,机械痛阈和热痛阈值与单独使用α,β-me ATP相比有所减少。6.vlPAG脑区微量注射MK-801后CCI大鼠的机械痛阈和热痛阈明显升高,具有统计学差异,MK-801的镇痛效应具有剂量依赖性和时间依赖性;使用MK-801在PAG微量注射进行预处理后,α,β-me ATP产生的镇痛效果被显著削弱,机械痛阈和热痛阈值与单独使用α,β-me ATP相比有所减少。7.vlPAG脑区微量注射MK-801和A-317491后,t DCS对CCI大鼠的镇痛效果明显下降,机械痛阈和热痛阈值在一段时间内明显的减低,差异具有统计学意义。结论:1.t DCS是一种有效的镇痛手段,选择合理的刺激参数可以提高的t DCS的镇痛效果,选择损伤后肢对侧的M1作为靶向区域进行重复多次的阳极电刺激,可以达到最佳的镇痛效果。2.在PAG水平,P2X3受体具有镇痛作用,抑制P2X3受体可以导致CCI大鼠的痛阈值下降,P2X3受体通过促进谷氨酸NMDA受体表达增加发挥镇痛作用。3.在PAG水平,NMDA受体具有镇痛和致痛两种作用,抑制NMDA受体可以导致CCI大鼠的痛阈值明显增高,说明NMDA受体参与了中枢伤害性信息的加工;但是抑制NMDA受体又可以削弱P2X3受体的镇痛作用,说明NMDA受体参与了P2X3受体的镇痛作用。4.t DCS通过促进PAG以及M1脑区P2X3受体和NMDA受体表达增加,激活中枢下行抑制通路发挥镇痛作用。