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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性关节滑膜炎为主要特点的自身免疫性疾病,目前认为抗原驱动及T细胞介导是RA发病的关键因素,有关其确切发病机制仍未完全明确,因而尚无满意的诊断方法和治疗药物。近年来蛋白质组学技术的飞速发展,为研究RA的发病机制和发现早期诊断的分子标记物提供了科学依据。本实验用二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析RA患者与外科创伤患者关节成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)蛋白质表达差异,为寻找RA关节滑膜特异性表达蛋白、RA的早期诊断、药物靶点筛选及发病机制探讨提供可靠的实验研究依据。
由于健康人滑膜组织难以获取,本实验中采用外科创伤患者作为对照组。取自经手术切除的RA患者和外科创伤患者的滑膜组织,采用胶原酶和胰酶结合消化法分离培养FLS,免疫细胞化学鉴定FLS内波形蛋白(vimentin)的表达。选用4～7代的FLS,裂解细胞获得细胞总蛋白,Bradford测定蛋白质浓度,利用2-DE分离RA患者及对照组FLS总蛋白质,凝胶经银染显色和Image Master图像软件分析凝胶图谱,从凝胶中切取差异蛋白质斑点,MALDI-TOF-MS分析得到相应的肽质量指纹图谱(peptide mass fmgerprinring,PMF),用Mascot查询软件搜索数据库鉴定蛋白,初步分析某些蛋白质在FLS中的功能,并对部分差异蛋白质点进行Western blot验证。
光学显微镜下可见,培养的FLS呈梭形或柱形,两极胞突细长,末端多与邻近细胞连接并交织成网状,呈现极向排列或涡旋生长。细胞核呈卵圆形,位于细胞中央,核仁明显。免疫细胞化学染色结果显示FLS胞浆内呈vimentin阳性反应,阳性细胞率达99％以上,符合成纤维细胞的特征。
RA患者和对照组FLS的2-DE图谱分别显示出1633、1603个蛋白质点。对二者相互匹配的蛋白质点进行差异分析,以差异量大于3倍的表达量为准,初步筛选出92个差异表达的蛋白质斑点,其中RA中表达上调和高丰度表达的蛋白有33个,下调表达的59个。挑选RA上调表达的33个点进行胶内原位酶解及MALDI-TOF-MS分析,成功鉴定出30个点,其中有6个蛋白质分子,如葡萄糖调节蛋白78(78 kDaglucose-regulated protein,BiP)、α-烯醇化酶(α-enolase,NNE)、核纤层蛋白(lamins-A/C,IMN1)、过氧化物还原酶1(peroxiredoxinl,PRDX1)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GSTM2)、蛋白质二硫化物异构酶A3前体(proteindisulfide-isomerase A3 precursor,ERp60)等己有文献报道在RA中呈现特异性表达,其中BiP是RA已知的自身抗原,另有24个是本研究新发现的具有潜在应用价值的分子标记物。根据数据库提供的信息,对鉴定的蛋白质按功能进行初步分类,主要涉及:①参与物质代谢或能量产生的生物酶类,如肿瘤型丙酮酸激酶(M2-pyruvatekinase,M2-PK),α-enolase;②细胞信号转导蛋白,如膜联蛋白(annexin A11,ANX11);③细胞结构蛋白,如lamin-A/C,核基质蛋白(ruvB-like1,NMP238);④分子伴侣,如葡萄糖调节蛋白(stress-70 protein,mitochonddal precursor,GRP75),αB-晶体蛋白(α-crystallin B chain,HspB5);⑤假定或未知蛋白,如PSME4,SELENBP1。
为进一步证实差异蛋白在RA中的特异表达,我们选择4个差异蛋白α-enolase、lamin—A/C、GRP75、M2-PK,运用Western blot技术对RA及对照组FLS中上述蛋白点的表达水平进行检测,证实这些差异蛋白均在RAFLS中呈上升表达或特异表达,从而验证了2-DE结果的准确性。
以上研究结果提示,RA患者与对照组FLS间存在差异表达的蛋白质,表明RA的发生是一个多种蛋白质分子参与的复杂过程。这些差异蛋白有可能构成RA关节滑膜的相关自身抗原,在诱导RA自身免疫反应中发挥一定作用。