少孢节丛孢milRNAs的功能与靶基因研究

• 作 者: 王纪爱
• 机 构: 云南大学
• 出 处: 云南大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 少孢节丛孢 milR-289 milR-799 糖基转移酶 硫氧还蛋白

少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）是一种在环境中广泛分布的捕食线虫真菌,可通过产生三维菌网的方式捕杀线虫,完成从腐生到寄生生活史的转化。作为研究与线虫互作的模式生物,其捕食器官形成的机制还不明晰。mi RNAs作为生物体基因表达的重要调控者,对捕食器官的形成调控亟待进一步探究。本实验室前期数据显示,在线虫提取液诱导少孢节丛孢捕食器官形成过程中,milR-289表达量会出现上升,milR-799表达量则从无到有。说明这两个milRNAs可能参与了三维菌网的形成过程。以此为出发点,本研究进行了少孢节丛孢milRNAs与靶基因互作调控捕食器官形成的机制初探。分别敲除编码milR-289和milR-799基因后,尿素诱导下,敲除株Δ289产捕食器官量降低,Δ799产捕食器官时间推后;在线虫提取液诱导下,Δ289与Δ799产捕食器官能力也均弱于野生型,说明milR-289、milR-799的确参与了少孢节丛孢捕食器官形成过程。动、植物中,mi RNAs成熟体的形成需要内切酶Dicer的剪切。在该基因转录水平显著降低的半敲除菌株ΔDicer中,少孢节丛孢已得到验证的七个milRNAs中的五个合成量显著降低（milR-19、milR-36、milR-352、milR-799、milR-837）,但milR-764和milR-289的合成量反而升高,说明在少孢节丛孢中Dicer参与了milRNAs的形成且存在其他剪切途径用于其成熟体的合成。进一步表型实验发现,菌株ΔDicer在不同培养基中的长势均弱于野生型,且孢子萌发出的菌丝呈现卷曲现象,异于野生型,这说明Dicer基因在少孢节丛孢可能为看家基因。此外,ΔDicer在尿素诱导下产捕食器官能力也弱于野生型。因此,少孢节丛孢milRNAs合成过程中的内切酶也可在一定程度上调控捕食器官的形成。生物信息学分析发现,milR-289及milR-799种子序列与基因ao0300281（编码糖基转移酶）及ao0304365（编码硫氧还蛋白）的3’UTR区均存在互补配对位点。分别敲除基因ao0300281及ao0304365后,与野生型相比,敲除株Δ0281在尿素、线虫提取液以及活线虫诱导下产捕食器官能力均增强且时间提前,而敲除株Δ4365则丧失了产捕食器官能力。进一步的双荧光素酶报告实验显示,milR-289和milR-799均与基因ao0300281 3’UTR区存在互作,且加入milRNAs抑制剂后互作消失;与基因ao0304365 3’UTR并不存在互作。因此,少孢节丛孢中存在两个milRNAs同时通过调控一个靶基因的表达而调节捕杀线虫过程的机制。在敲除株Δ0281中,与氨产生相关的基因GS1、GDH2以及与氨的分泌相关的amet基因转录水平均显著升高,因此,基因ao0300281对捕食器官形成的影响可能是通过氨代谢通路;在含具有细胞壁合成抑制剂SDS的培养基中,敲除株Δ0281生长受到抑制,说明基因ao0300281也可能通过影响细胞壁的合成调控捕食器官的形成。此外,表型实验还表明,基因ao＿289敲除株中分生孢子产量大幅度增加,而敲除株Δ4365的分生孢子产量则降低,两者都参与了分生孢子形成过程。抗逆性实验中,Δ4365在含有H2O2的培养基中无法正常生长,在含有SDS的培养基中长势变弱,因此,基因ao0305365还参与了抗氧化和细胞壁合成途径。敲除株Δ0281在含有H2O2或Na Cl的培养基中长势均弱于野生型,说明基因ao0300281也参与了维持渗透压平衡和抗氧化过程。因此,除了捕食器官形成外,这些基因还参与了少孢节丛孢中的其它生物学途径。本文的创新点:1.提出了少孢节丛孢中milR-289及milR-799在捕食器官形成中可能的调节通路。2.首次发现糖基转移酶和硫氧还蛋白在少孢节丛孢中参与捕食器官形成等生物学过程;